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时间:2019-06-29
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1、逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。【实验原理】1.逆境条件下(干旱、盐碱、热、冷害、冻害),植物体内脯氨酸含量会显著增加,并且积累指数与植物的抗逆性有关,因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯萃取,则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即
2、表示脯氨酸含量的高低。【实验材料】1.材料:小麦幼苗:(1)对照(2)100mM、200mMNaCl处理48h(3)5%、15%PEG-6000处理48h2.试剂:3%磺基水杨酸;冰醋酸;甲苯;2.5%酸性茚三酮溶液;脯氨酸母液50μg/ml3.器材:天平,烧杯,分光光度计,研钵,容量瓶,具塞试管,移液管,胶头滴管,水浴锅【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定(2)分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5%的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。(3)冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至
3、甲苯溶液。(4)轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。2.样品的测定(1)称取不同处理的小麦叶片各0.5g,于2.5ml3%磺基水杨酸试管中,沸水浴中提取10min。(2)吸取1ml上清于另一试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5%的酸性茚三酮,混合液于沸水中显色30min。(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在520nm比色。【实验结果】查标准曲线,得脯氨酸含量c(µg)脯氨酸含量(µg.g-1)=c×(v/a)/w其中V为提取液总体积ml
4、;a为测定液体积ml;W为样品质量g。1.标准曲线浓度(µg/mL)246810OD52010.0700.1400.2010.2930.33120.0870.1320.1930.3040.34130.0880.1510.2230.3180.344平均0.0820.1410.2060.3050.3391.样品测定处理平行质量OD520对照10.20180.20430.1570.17320.20680.188100mMNaCl10.20180.20260.6150.65720.20330.698200mMNaCl10.20060.20201.0080.94220.2
5、0340.8755%PEG-600010.20960.20950.0990.16720.20930.23415%PEG-600010.20280.20410.5860.5872020530.587将测得样品的OD520值带入标准曲线,得到的几种处理的脯氨酸含量分别为:处理OD520脯氨酸浓度(µg/mL)质量(g)脯氨酸含量(µg/g)对照0.1734.7640.2043233.2100mMNaCl0.65719.0410.2026940.1200mMNaCl0.94227.4480.20201358.85%PEG-60000.1674.5870.2095219
6、.015%PEG-60000.58716.9760.2041832.0【实验讨论】1.采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸,不仅大大减小了其他氨基酸的干扰,快速简便,而且不受样品状态(干或鲜样)限制。2.实验中甲苯的作用主要是萃取,以排除其他可能和茚三酮产生显色反应的物质使得测量值偏高。但同时有研究显示,未经甲苯萃取和经甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趋势是相同的,即应该高的数值两种方法都会高,因此,从污染小,经济,简便的方向考虑,如果不对脯氨酸进行精确的定量,只是用于作为一个植物抗性的生化指标,可以不使用甲苯的萃取。3.实验中在绘制标准曲线时,所设置的浓度范围
7、不太合适,因为没能把样品的OD520值包含进去。因此标准曲线并不是很可靠。应该将浓度继续增加,尽量使样品测定的OD520值能够包含进入曲线的浓度范围内,所得结果才准确。4.从实验结果中可以观察到,随着胁迫程度的增加,脯氨酸的含量也会显著增加。因此,可以说明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受胁迫大小的反映。而通过比较,发现盐胁迫比干旱胁迫对小麦造成的影响更大。5.实验结果中,经过5%PEG-6000(轻度干旱胁迫)处理的小麦叶片内的脯氨酸含量甚至比对照组的脯氨酸含量还要低(但相差不多)。而其他几种胁迫均有显著的使脯氨酸增加的效果,因此,除了操作过程中的一些误差外,
8、最重要的是轻度干旱可能不
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