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时间:2020-03-09
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1、植物组织游离脯氨酸含量的测定原理植物在逆境条件下,游离脯氨酸便会大量积累,且积累指数与植物的抗逆性有关。因此,脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸,不仅大大减少了其他氨基酸的干扰,快速简便,而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下,脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物,用甲苯萃取后,此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。材料、仪器设备及试剂1.材料植物叶片2.仪器设备分光光度计;水浴锅:漏斗:大试管(20m1);具塞刻度试管(20m1)注射器或滴管(5~lOml
2、)。3.试剂(1)3%磺基水杨酸溶液(2)甲苯;(3)2.5%酸性茚三酮显色液:冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合,作为溶剂进行配制,此液在4℃下2~3天有效;‘(4)脯氨酸标准溶液:准确称取25mg脯氨酸,用蒸馏水溶解后定容至250ml,其浓度为100ug.mL-l。再取此液10ml,用蒸馏水稀释至lOOml,即成10μg.mL-1的脯氨酸标准液。1.标准曲线制作(1)取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞,在沸水中加热40min。(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡,以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照
3、在波长520nm下比色。(3)以消光值为纵坐标,脯氨酸含量为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程表9.2.1各试管中试剂加入量试管0123456脯氨酸标准溶液(m1)00.20.40.81.21.62.0水(m1)21.81.61.20.80.40冰乙酸(m1)2222222茚三酮显色液(m1)3333333样品测定(1)脯氨酸提取:取不同处理的剪碎混匀植物叶片0.2~0.5g(干样根据水分含量酌减),分别置于大试管中,加入5m13%磺基水杨酸溶液,管口加盖玻璃球,于沸水浴中浸提10min。(2)取出试管,待冷却至室温后,吸取上清液2m1,加2m1冰乙酸和3
4、m1显色液,于沸水浴中加热40min,下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色(向各管加入5ml甲苯充分振荡,以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色)。(3)结果计算:从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数。脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)](C.V)·(a·W)-1式中:C一提取液中脯氨酸浓度(PS),由标准曲线求得:V-提取液总体积(ml)A---测定时所吸取得体积(ml)W-----样品重(g)
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