植物组织MDA含量测定

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1、植物组织MDA含量测定一、目的要求1．掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；2．深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA含量测定的意义；3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA形成的关系；4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA含量；5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。二、实验原理植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜

2、脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet—nine），又名三甲川，该物质在

3、532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收。由于TBA也可与其它物质反应，并在532nm处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的浓度。即：A532－A600＝ε·C·L式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值，C是MDA浓度，L为比色杯厚度，ε=155L·mmol-1·cm-1。TBAMDA3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA反应有干扰作用。可用下

4、列公式消除由蔗糖引起的误差。C（μmol·L-1）=6.45×(A532－A600)－0.56×A450三、材料与设备1．材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。2．仪器：(1)分光光度计；(2)冷冻离心机；（3）水浴锅；(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀；(7)5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml)；(10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3．药品(1)0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液；(2)5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到10

5、0ml；(3)0.5％的TBA溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml。四、实验步骤1．MDA的提取：取样品0.5g（W），加入2ml预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。4500rpm，4度，离心10min，上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积（V）。2．MDA含量测定：吸2ml（V2）的提取液于刻度试管中（空白为2ml缓冲液），加入3ml0.5％的TBA溶液，将试管放入沸

6、水浴中煮沸10min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。4500rpm，4度，离心10min，取上清液并量其体积（V1）。上清液于532nm、600nm波长下测定吸光度。3．结果计算:MDA(nmol·g-1)＝6.452×(A532－A600)×式中，V1为反应液总量（ml）；V2为反应液中的提取液数量(ml)；V为提取液总量（ml）；W为植物样品重量(g)。五、实验报告 样品处理重复A532A600MDA含量（nmol·g-1）       高温处理1   绿叶2   3   平均

7、   标准差     室温对照1   2   3   平均   标准差        黄叶  高温处理1   2   3   平均   标准差     室温对照1   2   3   平均   标准差   六、思考题1．TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？2．提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？3．为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？4．如果可溶性糖含量影响MDA含量的测定，你有什么办法消除其影响？5．正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。七、注意事项1．可溶性糖与TBA显色反应的

8、产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）。3．如待测液浑浊，可适当增加