MDA含量测定的具体操作.doc

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1、MDA含量测定具体操作—TBA法（南京建成试剂盒，货号：A003-1）一、实验目的：测定样品中MDA的含量（本实验为23个小鼠肝组织10%的组织匀浆上清液样本）二、实验原理：MDA和TBA缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰实验材料三、仪器：a)全波长酶标仪、离心机、涡旋混匀器、水浴锅或者电炉、96孔板、玻璃试管、2ml的EP管，保鲜膜，橡皮筋、标记笔、（ps:原本试剂盒是用紫外分分光光度计来进行测量，为了加快分析速度和节约试剂的成本，具体实验中使用了全波长的酶标仪）b)试剂：MDA试剂盒、待测样品、无水乙醇、冰醋酸、双蒸水四、实验步骤a)试剂一从冰箱中取出，放置常温至澄清后，

2、吸取2ml,备用b)本实验中需要使用试剂二应用液22.5ml,实际配制中取试剂二0.9ml,加入双蒸水25.5ml，即配制了26.4ml的试剂二应用液c)将之前配制好的试剂三，取出8ml的量（试剂三配制的过程中，需要加入热的双蒸水，在溶解过程中不断加热，根据试剂盒上说明的要求进行配制，保存的时候注意避光）d)标记好25个小的玻璃试管，按顺序放好；准备好200ul和1000ul的移液器枪头e)将各10%的肝组织匀浆上清液从冰箱中取出，融冻，备用；f)将处理后的样品按照下面的操作表，将200ul量程的移液器调至60ul,（如果样本没有出现溶血的现象时，可以用空白管代替对照管）ul空白管标准管

3、测定管对照管标准品60无水乙醇60测试样品6060试剂一60606060g)待样品和标准品加完以后，使用涡旋混匀器混匀ul空白管标准管测定管对照管试剂二应用液300300300300试剂三应用液30030030050%冰醋酸300h)涡旋混匀器混匀，试管口使用保鲜膜橡皮筋扎紧，用针头刺小孔，将玻璃试管5,6个分别扎在一起，防止后续试验倾倒。i)准备1000ml的大烧杯，加入一定量的水，在电炉上开始加热，在水中加入沸石，防止在加热的过程中暴沸，试管的标记要清楚，不易在煮沸过程中磨损j)在煮沸的条件下，同一批次同时加热在40-80min（MDA在实际的操作过程中显色不是很明显，因而延长加热时

4、间）k)反应完毕以后，取出玻璃试管，使用移液器移取1ml于2ml的EP管中进行离心，离心的条件为4000min,10min测定各管的吸光度。l)将离心完的反应试剂液吸取200ul到96孔板当中（加样的时候，注意不要吸到沉淀以及在加样过程中防止产生气泡，影响吸光度的测量），a)将酶标仪的波长调至532nm,测各个样本的吸光度b)根据公式：待测样品MDA=测定管OD值-空白管OD值标准管OD值-空白管OD值*标准品浓度÷待测样本蛋白浓度二、注意事项a)通常一批次的样品空白和标准管只需要做1-2只；b)在实验初期，因为样品量少，采用过小的EP管加热，但是在加热过程中，盖子基本弹开，因而仍采用玻

5、璃管进行加热；c)MDA试剂盒的使用，显色反应不明显，尽量提高匀浆的浓度和加热的时间，使得显色更加明显；d)试剂二应用液在配制的时候要注意，不要触碰到，对皮肤的损害比较大；e)在煮沸的过程中，对样品的标签损害比较大，要标记好，免得煮沸完，找不到相对应的样品，白忙活了；f)如果使用紫外分光光度计进行测量的同仁，只需要把剂量调大，具体的操作无异。g)有些未提及的注意事项，结合试剂盒说明书，希望你的实验做得顺利