脯氨酸含量测定

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1、逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。【实验原理】1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即

2、表示脯氨酸含量的高低。【实验材料】1.材料：小麦幼苗：（1）对照（2）100mM、200mMNaCl处理48h（3）5%、15%PEG-6000处理48h2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5%酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50μg/ml3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至

3、甲苯溶液。（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。2.样品的测定（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5g，于2.5ml3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10min。（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30min。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在520nm比色。【实验结果】查标准曲线，得脯氨酸含量c（µg）脯氨酸含量（µg.g-1）＝c×(v／a)／w其中V为提取液总体积ml

4、;a为测定液体积ml；W为样品质量g。1.标准曲线浓度(µg/mL)246810OD52010.0700.1400.2010.2930.33120.0870.1320.1930.3040.34130.0880.1510.2230.3180.344平均0.0820.1410.2060.3050.3391.样品测定处理平行质量OD520对照10.20180.20430.1570.17320.20680.188100mMNaCl10.20180.20260.6150.65720.20330.698200mMNaCl10.20060.20201.0080.94220.2

5、0340.8755%PEG-600010.20960.20950.0990.16720.20930.23415%PEG-600010.20280.20410.5860.5872020530.587将测得样品的OD520值带入标准曲线，得到的几种处理的脯氨酸含量分别为：处理OD520脯氨酸浓度(µg/mL)质量(g)脯氨酸含量(µg/g)对照0.1734.7640.2043233.2100mMNaCl0.65719.0410.2026940.1200mMNaCl0.94227.4480.20201358.85%PEG-60000.1674.5870.2095219

6、.015%PEG-60000.58716.9760.2041832.0【实验讨论】1.采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。2.实验中甲苯的作用主要是萃取，以排除其他可能和茚三酮产生显色反应的物质使得测量值偏高。但同时有研究显示，未经甲苯萃取和经甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趋势是相同的，即应该高的数值两种方法都会高，因此，从污染小，经济，简便的方向考虑，如果不对脯氨酸进行精确的定量，只是用于作为一个植物抗性的生化指标，可以不使用甲苯的萃取。3.实验中在绘制标准曲线时，所设置的浓度范围

7、不太合适，因为没能把样品的OD520值包含进去。因此标准曲线并不是很可靠。应该将浓度继续增加，尽量使样品测定的OD520值能够包含进入曲线的浓度范围内，所得结果才准确。4.从实验结果中可以观察到，随着胁迫程度的增加，脯氨酸的含量也会显著增加。因此，可以说明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受胁迫大小的反映。而通过比较，发现盐胁迫比干旱胁迫对小麦造成的影响更大。5.实验结果中，经过5%PEG-6000(轻度干旱胁迫）处理的小麦叶片内的脯氨酸含量甚至比对照组的脯氨酸含量还要低(但相差不多）。而其他几种胁迫均有显著的使脯氨酸增加的效果，因此，除了操作过程中的一些误差外，

8、最重要的是轻度干旱可能不