脯氨酸含量的测定方法.doc

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1、植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。二、仪器及试剂1.仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；2.试剂及配制：冰醋酸；甲苯。2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床

2、摇动溶解，贮于4℃冰箱中。3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制三、实验步骤1.脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。试剂管号0123451mg·ml-1脯氨酸标准液（ul）3%磺基水杨酸（ul）冰醋酸（ml）2.5﹪酸性茚三酮（ml）01000115995111099011159851120980112597511每管脯氨酸含量（μg）0510152025加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min（注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），

3、取出冷却，各试管再加入2ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。1.2以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定2.1脯氨酸的提取液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管,然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。（注意：样品一定要精确称量并记录）离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。2.2测定加入1ml冰醋酸及1ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。

4、冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。四、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：C*稀释倍数*提取液总量（ml）脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）公式中：C---从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）;稀释倍数（如果见样品中甲苯红色太深，可以吸取一定量的萃取液经甲苯稀释后再测量）;提取液总量---1.5ml，测定时提取液用量---1.5ml磺基水杨酸提取后吸取了

5、多少，一般吸取1ml。五、注意事项:1. 配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现配。2. 测量新样品时，用甲苯冲洗比色杯。3.试剂添加次序不能出错。4.记得称量样品鲜重