乳制品羟脯氨酸含量测定方法

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1、乳制品中L－羟脯氨酸含量的测定方法1范围本方法为乳制品中L-羟脯氨酸的测定方法。本方法适用于乳制品中L-羟脯氨酸的测定。3引用标准GB9695.23-2008肉与肉制品羟脯氨酸含量测定2术语与定义乳制品中L-羟脯氨酸含量hydroxyprolinecontentoffoods在本方法规定的条件下测定的L-羟脯氨酸的含量。L-羟脯氨酸含量用质量分数表示。4原理用硫酸于105℃水解试样，释放出L-羟脯氨酸。L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲胺基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行比色测定。L-羟脯氨酸存在于动物胶、骨胶原或动物的结

2、缔组织中。水解动物蛋白(HAP)（Hydrolyzed animal protein ，中文别名：酶解胶原蛋白）中L-羟脯氨酸含量约为10%，对于乳与乳制品本身组成成分中不存在L-羟脯氨酸，但产品标准中有氮、蛋白质或氨基酸含量的规定的乳与乳制品，可通过本方法检测L-羟脯氨酸的含量并推算出动物水解蛋白的大体含量，可鉴别检验样品是否添加动物水解蛋白，以及动物水解蛋白的大体含量。通过4试剂如无特别说明，所用试剂均为分析纯。水为蒸馏水或去离子水，或相同纯度的水。4.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]量取750mL水于2L的烧杯中，在搅拌下

3、缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却到室温后转移至2L容量瓶中，用水定容。4.2缓冲溶液（pH=6.8）包括下列组分：a)26.0g一水柠檬酸（C6H8O7.H2O）；b)14.0g氢氧化钠；c)78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。4.3氯胺T溶液3称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL缓冲溶液（4.2）溶解。临用时配制。4.4显色剂称取10.0g对二甲胺基苯甲醛，用3

4、5mL高氯酸溶液[60%(质量分数)]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。若对二甲胺基苯甲醛需纯化（见8.4注），可按如下操作：用70%（体积分数）热乙醇配制对二甲胺基苯甲醛饱和溶液。依次在室温和冰箱中冷却，12h后，用布氏漏斗过滤。用少量70%（体积分数）乙醇洗涤布氏漏斗中的固体。将固体转移至三角瓶中，用70%（体积分数）热乙醇重新溶解固体，加入冷水充分搅拌，至有大量乳白色晶体析出，于冰箱中过夜。用布氏漏斗过滤固体，用50%（体积分数）乙醇洗涤后，在有五氧化二磷干燥剂的条件下进行真空干燥。4.5L-羟脯氨酸标准溶液4.5.1标准储备

5、液称取50mgL-羟脯氨酸于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（4.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。4.5.2标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度依次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL。临用前配制。5仪器和设备及材料实验室常规仪器及下列仪器、材料。5.1分析天平：感量0.0001g。5.2三角瓶：容量为100mL，长颈

6、，小口。5.3表面皿：直径为5cm～6cm。5.4干燥箱：可控温于105℃±1℃。5.5圆形滤纸：直径为12.5cm。5.6容量瓶：250mL、100mL。5.7比色管：25mL。5.8铝箔或不透明塑料薄膜。5.9水浴锅：可控温于60℃±1℃。5.10分光光度计：可用波长558nm±2nm；或使用光电比色计，其中干涉滤波器最大吸收波长为558nm±2nm。5.11比色皿：光程为1cm。6分析步骤6.1试样制备贮藏在冰箱中液体食品，在实验前取出并达室温。6.1.1液态试样准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于100mL三角瓶中（5.2

7、），避免试样粘在三角瓶壁上。6.1.2固态试样3准确称取均匀试样2～5g，精确至0.0001g，置于100mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶壁上。（若加入硫酸溶液（4.1）后糊底，不能摇匀，如乳粉等试样，可准确称取均匀试样15g，精确至0.0001g，置于烧杯中，加入水搅拌均匀，并定容于100mL容量瓶中。准确吸取10mL于100mL三角瓶中，避免试样粘在三角瓶壁上。）6.1水解6.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液（4.1），加入三角瓶中，用表面皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。6.2.2用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250m

8、L容量瓶中，用10mL硫酸溶液（4.1）分三次洗涤烧瓶和滤纸，再用水洗涤，用水定容，摇匀。（注意开始过滤时滤纸和漏斗干燥无水滴）。6.2.3用移液管移取10mL水解产物（6.2.