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《组织贴块法培养小鼠气道平滑肌细胞_卓致远》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第16卷第2期中国组织化学与细胞化学杂志Vol.16.No.22007年4月CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMISTRYApr.2007组织贴块法培养小鼠气道平滑肌细胞*卓致远黄茂崔学范殷凯生(南京医科大学第一附属医院呼吸内科,南京210029)1关键词2小鼠;气道平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法;差速贴壁法1中图分类号2R3311文献标识码2A哮喘是慢性气道炎症性疾病,以气道高反应性小鼠断颈处死,在75%酒精内浸泡2min,迅和可逆性气道阻塞为主要临床特征,而气道重建作速分离气管段,置入含100U/ml青链霉素的D-为哮喘的重要
2、病理特征,对气道高反应性的形成起Hanks液中,转入超净台,去净血污和残存结缔着重要作用。而气道平滑肌增厚是产生气道阻塞的组织,纵形剖开气管,小心剥离外膜并轻轻刮除内[1]3重要原因,与气道高反应性的发生密切相关。体膜,用眼科剪将气管段小心剪成1mm的小组织外气道平滑肌细胞(airwaysmoothmusclecells,块,贴于25ml培养瓶底面,等距排列,加入含ASMC)的培养和细胞株的建立是研究细胞生物学20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基2ml,不行为,研究疾病发病机制及其防治手段的基础。因使培养液接触组织块。将培养瓶底面向上,于此掌握一种简便、高效的平滑肌细胞培养技
3、术对呼37e,5%CO2孵箱中绝对静置约3h,使组织块接吸系统疾病方面的科研工作者而言具有重要意义。近干涸,轻轻翻转培养瓶,使培养液刚好没过组织[2,3]ASMC培养常用的培养方法有贴块法和酶解离块表面,半开放式绝对静置培养3d后将培养液添[4]法。由于小鼠气管组织较少,故作者选择组织贴至5ml,第6d全换液,此后每3d换液一次。块法进行细胞的原代及传代培养,应用多种方法纯3.ASMC传代培养化细胞,短期内获得了大量较高纯度、生长状态良光学显微镜下观察,组织块外缘细胞逐渐汇合好的气道平滑肌细胞。达80%以上,即可进行首次传代:倒掉培养液,材料和方法用4eD-Hanks液2ml清
4、洗细胞2-3遍,弃尽清洗液,加入2ml0125%胰酶溶液,轻晃培养瓶使1.实验动物和试剂其掠过组织块表面,吸弃大部分胰酶,孵箱内静4)8周龄雄性Balb/c小鼠,购自上海动物中置。约10min后,镜下观察细胞边缘透亮,胞质心。DMEM高糖培养基购自Hyclone公司;胰蛋回缩时,加入含15%胎牛血清的DMEM6ml培养白酶粉、D-Hanks液、PBS干粉均购自美国JRH液终止消化,用细弯头滴管反复吹打瓶壁生长面,公司;优级胎牛血清购自杭州四季青公司;青霉素形成的细胞悬液以1B2接种,补齐培养液,每3d钠、硫酸链霉素购自华北制药厂;小鼠抗A-actin换液。单克隆抗体,SABC-
5、FITC免疫组化试剂盒购自武4.ASMC的纯化汉博士德公司。在ASMC的原代培养过程中,不免混杂有其2.ASMC原代培养它细胞,主要是成纤维细胞,尚有少量上皮细胞和1收稿日期22006-07-311修回日期22006-09-06内皮细胞需要纯化去除。1作者简介2卓致远,女(1981年),汉族,硕士研究生。411自然纯化即利用平滑肌细胞的增殖优*通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed)势,抑制其它细胞特别是上皮细胞和内皮细胞的生248中国组织化学与细胞化学杂志第16卷长,最后留下增殖较旺盛的平滑肌细胞。随着传代出玻片,置激光共聚焦显微
6、镜下观察。的次数增加,平滑肌纯度会逐渐增高,以此达到去结果除其它细胞的纯化目的。412人工纯化在组织取材过程中注意结缔1.ASMC生长情况组织的剥离去除,在保留平滑肌的前提下尽量干净组织块接种后一般2-3d即有圆形小细胞爬地刮除内外膜。在培养过程中仍混有的细胞用以下出,3-7d贴壁(图1),待细胞中心汇合需要传代方法除去:一般要8-14d左右。传代细胞约需5-10d即长满41211机械划除法即采用机械方法破坏而瓶底,需再次传代。至第5代细胞传代仍存活良去除不需要的细胞,保留平滑肌细胞:在倒置显微好。镜下观察细胞形态,用记号笔画出成纤维细胞、上2.ASMC鉴定皮细胞或内皮细胞的生
7、长克隆,在超净台内用弯头211细胞形态学鉴定应用倒置相差显微镜观吸管在标记区域内反复推划,去除不需要的细胞,察,ASMC未汇合之前多呈梭形或多边形,内有1推划后用D-Hanks液冲洗两次,加培养液继续培-2个细胞核,可向细胞密度低的方向伸出一至数养。可反复多次以达到纯化细胞的目的。个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列,呈典41212差速贴壁法由于成纤维细胞与平滑型/峰谷0状(图2)。肌细胞相比,其贴壁过程快,贴壁时间大约为10212免疫细胞化学鉴定对平滑肌细胞特异-30min,而平滑肌细胞
