组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定.doc

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1、组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定　　摘要：目的培养、鉴定SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞。方法采用组织块贴壁法分离培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞，胰蛋白酶消化传代，并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果培养出的平滑肌细胞呈长梭形生长，镜下可见培养细胞呈典型的“峰谷”状生长，高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法体外培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞操作简单、纯度较高、可行性高。　　关

2、键词：平滑肌细胞；组织块培养；鉴定；SD大鼠　　中图分类号：R329文献标识码：A　　20世纪末有研究表明，血管平滑肌细胞过度生长是高血压条件下血管重构的经典机制[1，2]。平滑肌细胞异常增殖和纤维化引起血管壁增厚和管腔狭窄，造成血管重构，可促进高血压等疾病的形成和发展，并可影响心、脑、肾等重要器官的结构与功能，最终导致这些器官功能衰竭，是导致心血管疾病死亡的主要原因之一。近年来随着研究进展的深入，抑制血管平滑肌增殖对心脑血管疾病的预防受到越来越多学者的关注。体外培养血管平滑肌细胞是研究血管平滑

3、肌细胞生物特性的基础。本实验利用SD大鼠腹主动脉成功分离、培养出血管平滑肌细胞，希望能为该类实验研究提供纯度高、结构和功能良好的平滑肌细胞。　　1材料与方法　　1.1动物SPF级SD大鼠，雄性，体重g。　　1.2仪器与试剂倒置相差显微镜；荧光倒置显微镜；超净工作台；CO2培养箱；胎牛血清；DMEM培养基；胰酶细胞消化含0.25%胰酶和0.02%EDTA；小鼠抗大鼠SMαactin单克隆抗体；即用型SABC免疫组化染色试剂盒；3，3’氨基联苯胺显色试剂盒；青霉素钠、硫酸链霉素。　　1.3细胞培养　

4、　1.3.1原代培养将SD大鼠断颈处死，在无菌条件下取其腹主动脉段，立即置于含青霉素钠、硫酸链霉素的无菌PBS液体中。将其移入超净工作台上，在盛有PBS液的培养皿上清除结缔组织，完整剥除动脉外膜。用PBS液漂洗次后，纵向剖开血管，将血管内膜面向上平铺于培养皿上，用眼科弯镊钝性刮除内膜，以去除内皮细胞，动作轻柔以免破坏血管中膜。剪去血管两端钳夹过的组织，再用PBS液清洗3次，放入盛有含20%胎牛血清、青霉素钠100U/mL，硫酸链霉素的DMEM培养液中，用眼科弯剪反复将其剪成1mm×1mm左右的小

5、组织块，用弯头吸管移入培养瓶中。以0.5cm左右的间距将组织块均匀分布于培养瓶底部。轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内注入含20%胎牛血清、青霉素钠100U/mL，硫酸链霉素的DMEM培养液mL，然后瓶盖旋松，置于CO2培养箱中静置5h～6h使组织块干涸并与瓶底贴壁附着后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置于CO2培养箱中3d～5d。待有细胞从组织块周围游出后换液，以后2d～3d换液1次。　　1.3.2细胞换液当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变为黄色时，则需换液。在超净工作台

6、上，吸弃原培养基，用PBS液轻轻冲洗2遍后，加入新鲜含20%胎牛血清的DMEM培养基4mL继续培养，也可进行半量或1/3量换液。换液时应动作轻柔，尽量不要碰到组织块。　　1.3.3细胞传代至单层细胞铺满近培养瓶底的80%～90%以上传代。将原代细胞瓶内的培养液小心吸弃，加入PBS液2mL轻晃培养瓶冲洗细胞2次，吸弃，加0.25%胰酶液2mL在37℃消化约40s。在倒置显微镜下见细胞回缩、变圆，细胞成片收缩呈球形时，立即加入含血清培养基终止消化。然后轻轻吹打瓶壁细胞使其完全脱落，形成的细胞悬液在镜

7、下计数，按1∶2接种。周期为5d～7d。首次传代时，脱落的组织块可以转移到新的25cm培养瓶中，静置于37℃的CO2孵箱中，按原代培养方法使组织块重新贴壁。24h后可见细胞重新贴壁生长。以后2d～3d换液1次，1周左右后细胞再次长成致密单层时即可再次传代。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去，待细胞传代至代，即可用于实验。　　1.4平滑肌细胞鉴定　　1.4.1细胞形态学观察用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。　　1.4.2细胞存活率的检测消化传代的细胞悬液9滴，加入1滴0

8、.4%台盼蓝液，混匀后3min内吸取1滴于血球计数器上，置显微镜下观察，凡着色细胞均为不正常细胞或死亡细胞。共计数1046个细胞。　　1.4.3细胞免疫组化第5代对数生长期的细胞悬液接种到培养瓶中，培养2d～3d取出盖玻片，PBS漂洗5min×3次，4%的多聚甲醛室温下固定min，PBS再次漂洗5min，3次，然后按照即用型SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作。　　2结果　　2.1平滑肌细胞培养及形态学观察原代培养6d～7d，倒置显微镜下可观察到少量细胞自组织块边缘游出