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1、组织块法培养兔主动脉平滑肌细胞【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;兔Abstrct:ObjectiveTodiscussthemethodforprimarycultureofrabbitarterialsmoothmusclecells.Toprovideusefulvitromodelfortheetiopathogenisisofcardiacvasculardiseases.MethodsRabbitarterialsmoothmusclecellsethodandcouldbepassaged.Theformofrabbi
2、tarterialsmoothmusclecellsicroscopeandethodofimmunocytochemistry.ResultsRabbitarterialsmoothmusclecellsethodandcouldbepassaged.Underinvertedphasecontrastmicroscope,thegromunocytochemistrystaining,allthecellscytoplasmentbundles.ConclusionsTheculturetecheniqueoftissueexp
3、lantsadherentmethodhastheadvantagesofeasytooperate,highefficiencytoobtainVSMCsinashortercycletime,highpurityandsoon.Theyaregoodvitromodelofcardiacvasculardiseases.Keyaryculture;rabbit近年来，越来越多的证据表明血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖在冠状动脉粥样硬化、高血压病等疾病的发生发展中起重要作用。因此
4、，体外培养VSMCs为探索临床治疗干预途径提供了一个良好的实验对象。目前，培养大鼠、小鼠VSMCs的报道较多，而培养兔VSMCs的报道相对较少,本实验在参照文献［1-3］的基础上,结合自已的一些经验,成功培养兔主动脉平滑肌细胞并传代。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物健康日本大耳兔,雌性，1.0～1.5kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。1.1.2培养材料和试剂高糖DMEM培养液，1∶250胰蛋白酶（美国sigma公司），胎牛血清（FBS,杭州四季青生物科技责任公司），小鼠抗兔α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，即用型SABC试剂盒
5、（武汉博士得生物工程有限公司），一次性培养瓶(美国Corning)。1.2方法1.2.1获取兔主动脉平滑肌细胞取健康日本大耳兔1只,空气栓塞致死，无菌条件下取出主动脉，放入装有培养液的培养皿中，PBS反复清洗血迹，干净后用小镊子剥除外膜纤维结缔组织,用眼科剪将血管纵行剪开,平铺在培养皿中，使内表面朝上，用眼科弯镊刮除血管内膜，以去除内皮细胞，剩余血管中膜组织透明、较薄、韧性好,浸泡于PBS中并冲洗干净,而后移入10mL小瓶中,加入1mL培养液,剪成约1mm3的组织块，将其移入培养瓶，摆布均匀,翻转培养瓶，使瓶底向上,组织块位于培养瓶
6、上方,加入4～5mL含20％FBS的DMEM培养液，旋松瓶口，放入CO2孵箱培养。3～4h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，绝对静置培养3d。4～6d后换液,可见散在、梭形细胞从组织块边缘爬出。8～10d出现致密细胞层,隔天换液1次。1.2.2细胞传代培养细胞生长融合成致密单层细胞时即可传代。倾去原培养液，PBS洗涤瓶壁细胞2～3次，0.25％胰蛋白酶溶液消化，室温2～3min，初次消化细胞敏感，30s即可。镜下见大部分细胞收缩，边缘清楚时，翻转培养瓶停止消化，倒去消化液，加入培养液终止消化。反复吹打瓶壁细胞，使其脱落，制成单
7、细胞悬液，接种于新培养瓶，以细胞量决定分装比例，补足培养液，置于孵箱培养。次日换液，细胞铺满瓶底时（约2～4d），依同法传代。1.2.3细胞形态学观察倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。1.2.4免疫细胞化学鉴定小鼠抗兔α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体；生物素化山羊抗小鼠IgG(即用型SABC试剂盒）。本实验采用SABC法对第3代VSMC与爬片进行免疫细胞化学染色。1.2.5细胞冻存和复苏选生长良好的第4代细胞进行冻存,将封闭好的冻存管依次放入4℃，60min;-20℃,4h;-70～-80℃,2个月。复苏后细胞形态和性状保持不变。2结
8、果2.1倒置相差显微镜观察原代培养于3～4d可见组织块边缘有细胞游离，不同组织块细胞游离时间略有差别，细胞逐渐生长形成细胞晕，相互接触形成细胞簇。原代细胞呈梭形，束状排列，平行生长，典型“峰—谷”样生长，成“峰”部位细胞密集生长，而成
