改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞.doc

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1、改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞作者：李成武，李应续，朱从丽，宋健【摘要】目的探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）的方法，为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。方法提取大鼠的胸主动脉，采用混合酶消化后，采用含10%FCSRPMI1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖，倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状，免疫组织化学进行细胞鉴定。结果消化肌平滑肌细胞24h后贴壁，平均贴壁率为76%，第5d后细胞数迅速增加，至第11d形成单层时，光镜下出现“峰谷”样生长；传代后，细胞的生长特性无改变，

2、αSMA免疫组化染色检测，证实细胞是VSMC。结论改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。【关键词】酶消化法;平滑肌细胞;胸主动脉;SD大鼠ABSTRACT:ObjectiveToexplorethecultivationofratvascularsmoothmusclecells(VSMC)byenzymaticdispersionwhichhelpstoprovideidealsforthepreventionandtreatmentofangioscleroticdiseases.MethodsThethoracica

3、rterywasimmediatelyremovedandcutintofinetissuepieces,thenwasincubatedinamixedmedium.Afterdigestion,thecellswereculturedinRPMI1640with20%FCSandthenplatedontoplastictissueculturedishes.Theproliferationofcellwasassayedbycellcounting,thefeatureofvascularsmoothmusclecellswasobser

4、vedwithinvertedphasecontrastmicroscope,andimmunohistochemicalmethodwasusedtoindentifycells.ResultsAfter24hofincubation,VSMCsbegantosticktothewalloftheincubationdishes,andtheadherentratewas76%.After5thday,thecellnumberwasincreasedrapidly,andtheyformmonolayeron11thday.A"thepea

5、kvalley"typeofgrowthcouldbeobservedbylightmicroscope.Afterpassages,thegrowthcharacteristicsofcellsdidnotchanged,andtheconfirmationcellwasVSMCbyαSMAimmunohistochemicaltesting.ConclusionTheimprovedenzymaticdispersionmethodforVSMCcanincreasethecellstabilityofbiologicalcharact

6、eristicswithshorttime.KEYWORDS:Enzymaticdispersion;Vascularsmoothmusclecell;Thoracicaortat;SpragueDawleyrat4动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养是研究平滑肌细胞分子生物学的有效手段，尤其可为平滑肌细胞的增殖、迁移相关的心血管疾病的病因、机理研究提供良好的实验模型。目前，国内、外介绍平滑肌细胞的培养主要是组织贴块法和酶消化法。具体的操作各不相同,各有优、缺点。本文介绍本实验室通过改良酶消化法，采用胶原酶、弹性酶和脱氧核糖核酸酶消化主动脉平滑

7、肌细胞，探讨大鼠VSMC原代培养的新方法。1材料与方法1.1主要试剂与动物雌性成年SpragueDawley大鼠（体质量160～180gSPF）由武汉大学动物实验中心提供。胶原酶Ⅱ型（BY60619Sigma）；弹性蛋白酶（E7885，Sigma）；脱氧核糖核酸酶Ⅰ型（D5025,Sigma）；α平滑肌肌动蛋白抗体（BM0002Boster）;胎牛血清（16000044，Gibco）；FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗。1.2主要溶液①DHank's液（g／L）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8g，NaHCO30.3

8、5g，Na2HPO40.0318g；②RPMI1640培养基（含10%FCS）：培养粉1.04g，双抗2ml，谷氨酰胺4ml，FCS10ml，加双蒸水