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时间:2018-08-31
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1、改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞作者:李成武,李应续,朱从丽,宋健【摘要】目的探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)的方法,为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。方法提取大鼠的胸主动脉,采用混合酶消化后,采用含10%FCSRPMI1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖,倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状,免疫组织化学进行细胞鉴定。结果消化肌平滑肌细胞24h后贴壁,平均贴壁率为76%,第5d后细胞数迅速增加,至第11d形成单层时,光镜下出现“峰谷”样生长;传代后,细胞的生长特性无改变,
2、αSMA免疫组化染色检测,证实细胞是VSMC。结论改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。【关键词】酶消化法;平滑肌细胞;胸主动脉;SD大鼠ABSTRACT:ObjectiveToexplorethecultivationofratvascularsmoothmusclecells(VSMC)byenzymaticdispersionwhichhelpstoprovideidealsforthepreventionandtreatmentofangioscleroticdiseases.MethodsThethoracica
3、rterywasimmediatelyremovedandcutintofinetissuepieces,thenwasincubatedinamixedmedium.Afterdigestion,thecellswereculturedinRPMI1640with20%FCSandthenplatedontoplastictissueculturedishes.Theproliferationofcellwasassayedbycellcounting,thefeatureofvascularsmoothmusclecellswasobser
4、vedwithinvertedphasecontrastmicroscope,andimmunohistochemicalmethodwasusedtoindentifycells.ResultsAfter24hofincubation,VSMCsbegantosticktothewalloftheincubationdishes,andtheadherentratewas76%.After5thday,thecellnumberwasincreasedrapidly,andtheyformmonolayeron11thday.A"thepea
5、kvalley"typeofgrowthcouldbeobservedbylightmicroscope.Afterpassages,thegrowthcharacteristicsofcellsdidnotchanged,andtheconfirmationcellwasVSMCbyαSMAimmunohistochemicaltesting.ConclusionTheimprovedenzymaticdispersionmethodforVSMCcanincreasethecellstabilityofbiologicalcharact
6、eristicswithshorttime.KEYWORDS:Enzymaticdispersion;Vascularsmoothmusclecell;Thoracicaortat;SpragueDawleyrat4动脉平滑肌细胞(VSMC)的培养是研究平滑肌细胞分子生物学的有效手段,尤其可为平滑肌细胞的增殖、迁移相关的心血管疾病的病因、机理研究提供良好的实验模型。目前,国内、外介绍平滑肌细胞的培养主要是组织贴块法和酶消化法。具体的操作各不相同,各有优、缺点。本文介绍本实验室通过改良酶消化法,采用胶原酶、弹性酶和脱氧核糖核酸酶消化主动脉平滑
7、肌细胞,探讨大鼠VSMC原代培养的新方法。1材料与方法1.1主要试剂与动物雌性成年SpragueDawley大鼠(体质量160~180gSPF)由武汉大学动物实验中心提供。胶原酶Ⅱ型(BY60619Sigma);弹性蛋白酶(E7885,Sigma);脱氧核糖核酸酶Ⅰ型(D5025,Sigma);α平滑肌肌动蛋白抗体(BM0002Boster);胎牛血清(16000044,Gibco);FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗。1.2主要溶液①DHank's液(g/L):KCl0.4g,KH2PO40.06g,NaCl8g,NaHCO30.3
8、5g,Na2HPO40.0318g;②RPMI1640培养基(含10%FCS):培养粉1.04g,双抗2ml,谷氨酰胺4ml,FCS10ml,加双蒸水
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