哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法探讨

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1、哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法探讨作者：卢虹蓓，张维溪，李昌崇【摘要】　　目的：探讨哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法，了解其生长特性。方法：制作慢性哮喘大鼠模型，用酶解离法、组织贴块法分别培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫组化SP法分析SMα-action抗原的表达。结果：以酶解离法培养2～3d可见细胞贴壁，7～9d可融合；以贴块法培养7～10d组织块周围有细胞长出，10～14d融合，传代后细胞“谷峰”生长明显。SMα-action免疫组化SP法染色均呈阳性。结论：两种方法均能培养出纯度较高的哮喘大鼠平滑肌细胞，其中酶解离法细胞产量高，纯度高，生长

2、速度快，能为气道疾病细胞实验提供可靠的细胞模型。【关键词】大鼠哮喘气道平滑肌细胞培养　　支气管哮喘(简称哮喘）是儿童最常见的一种慢性炎症性疾病，气道重塑是引起慢性哮喘患者气道不可逆或部分不可逆阻塞的病理基础[1]，是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要原因。平滑肌增生肥大是气道重塑的病理学特点之一[2]，故体外气道平滑肌细胞(airwaysmoothmuscle9cells，ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。ASMC培养常用的培养方法有贴块法和酶解离法[3-4]。本研究用以上两种方法培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，观察其生长特点，并进行比较。　　1材料和方法　　1.1实验

3、动物和试剂4～6周龄雄性SD大鼠，购自上海动物中心。DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液、特级胎牛血清购自法国Biowest公司；D-Hanks液、青链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；I型胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA)购自美国Biosharp公司；大鼠抗α-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司；SP免疫组化试剂盒(二抗)购自上海晶美生物工程有限公司。　　1.2慢性哮喘大鼠气道重塑模型的建立参考李昌崇等[5-6]的方法复制哮喘慢性模型，致敏阶段：第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5mL[内含OVA1mg和Al(O

4、H)3100mg]；激发阶段：第15天开始以1%OVA生理盐水溶液雾化吸入，隔天一次，每次30min，共60d。　　1.3细胞培养　　1.3.1ASMC原代培养：组织提取步骤为：以10%水合氯醛（4009mg/kg）腹腔注射处死大鼠，以75%酒精消毒表皮，从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管及肺部组织，剪去心脏，置入含100U/mL青链霉素的4℃D-Hanks液中，转入超净台，依次去除肺组织、支气管动静脉、脂肪和残存结缔组织，仅剩余气管、支气管。纵向剖开气管、支气管，用外科刀片小心刮除外膜及内膜至组织呈透明状态，用眼科虹膜剪将气管段剪

5、成1mm或更小的组织块。　　组织贴块法：将剪好组织块用牙科探针贴于50mL培养瓶底面（或者直接种于直径6cm培养皿），等距排列，间隔0.5～1mm，将培养瓶倒置，加入含20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基2mL，不使培养液接触组织块。盖紧瓶口后静置约使组织块接近干涸（约3h），轻轻翻转培养瓶，使培养液刚好没过组织块表面，拧松瓶口静置培养3d后将培养液添至5mL，第6天全换液，此后每3天换液一次。　　酶解离法（胶原酶-胰酶混合消化法）：将剪好组织块装入15mL离心管中，加入配制好的I型胶原酶溶液2mL（用D-Hanks液配制成含I型胶原酶2mg/mL、木瓜蛋白酶2.5mg/m

6、L、牛血清白蛋白2.5mg/mL的溶液），玻璃滴管轻轻吹打混匀，置入37℃，5%CO2孵箱中消化25min，取出后用含胎牛血清的DMEM(高糖)培养基终止消化，1000r/min离心5min，弃去上清液，再加0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液2mL，以同样方法消化15min，离心去上清，加入20%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基约1.5mL，半开放式培养，3d后换液。9　　1.3.2ASMC传代培养：倒置相差显微镜下观察，组织块外缘细胞逐渐汇合达80%以上，即可进行首次传代：倒掉培养液，用4℃D-Hanks液清洗细胞2～3遍，弃尽清洗液，加入0.25%胰酶溶液2mL，

7、孵箱内静置。约5min后，镜下观察大部分贴壁细胞已脱离瓶底，边缘透亮，胞质回缩，轻晃瓶身可使剩余贴壁细胞掉落。加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，形成的细胞悬液以1～10×106/mL接种，每3天换液1次。根据作者经验，1瓶生长良好原代细胞每次可以传代约4～5瓶。　　1.3.3ASMC的纯化：在组织取材过程中注意结缔组织的剥离去除，在保留平滑肌的前提下尽量干净地刮除内外膜。在培养过程中利用平滑肌细胞的增殖优势，抑制其他细胞的生长，随着传代的次数增加，平滑肌纯度会逐渐增高。胶原酶-胰酶混合消化法