七鳃鳗丝裂原活化蛋白激酶P38α、β分子的克隆、重组表达及相关免疫学研究

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1、分类号:学校代码:10165密级:学号:201511000910硕士学位论文七鳃鳗丝裂原活化蛋白激酶P38α、β分子的克隆、重组表达及相关免疫学研究作者姓名：张依杉学科、专业：细胞生物学研究方向：细胞分化调控和细胞信号转导导师姓名：刘欣教授2018年4月摘要P38MAPK是MAPK家族的一个亚类，在高等脊椎动物免疫应答的细胞信号转导过程中扮演着非常重要的角色。目前为止，对于P38MAPK的研究大多都是针对哺乳动物，而对无颌类脊椎动物中是否存在P38MAPK及其功能尚不清楚。由于七鳃鳗不仅是现存的低等无颌类脊椎动物的重要代表，而且还是无脊椎动物向脊椎动物进化过

2、程中具有承上启下意义的一个重要类群。因此，本文选择以P38MAPK作为研究对象，探索P38MAPK在七鳃鳗中是否存在，以及在七鳃鳗免疫防御过程中所起的作用。这样不仅可以揭示P38MAPK分子家族从低等到高等脊椎动物的分子进化过程，也为进一步深入了解无颌类脊椎动物免疫应答的分子机制奠定基础。在之前的转录组测序实验结果中，我们发现日本七鳃鳗（Lampetrajaponica）的P38MAPK以两种异构体P38α(MAPK14)和P38β(MAPK11)的形式存在。我们通过根据之前得到的日本七鳃鳗P38α和P38β的部分序列以及海七鳃鳗（petromyzonmar

3、inus）基因组中的核酸序列重新设计了MAPK14和MAPK11的引物，通过巢式PCR法进行分子扩增，成功得到了完整的日本七鳃鳗MAPK14（Lja-MAPK14）和MAPK11（Lja-MAPK11）的开放阅读框（ORF区）序列。我们利用多种生物信息学分析软件对其蛋白一级、二级及三级结构进行了多种分析并构建了系统发育进化树，探讨了P38MAPK家族分子的分子进化机制，为以后实验的设计和实施打下了良好的理论基础。在成功的克隆了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的基础上，又成功的构建了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的重组表达质粒，并将其转化

4、到表达菌株E.coliBL21中进行了表达。对其可溶性进行检测发现Lja-MAPK14和Lja-MAPK11均以包涵体的形式表达，并且两者皆可利用人源P38的多克隆抗体通过免疫印迹方法进行检测。为了进一步了解Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的功能，我们通过半定量PCR，实时定量PCR和免疫印迹等方法检测了它们在免疫相关组织中随免疫应答时间变化在mRNA和蛋白水平的表达谱。利用免疫荧光方法检测了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11在类淋巴细胞中的定位。实时定量PCR和免疫印迹的结果表明，混合菌免疫后Lja-MAPK14和Lja-MAPK11在单

5、个核白细胞和髓样小体中都出现了明显的上调现象。免疫荧光方法检测发现，Lja-MAPK14/Lja-MAPK11（P38MAPK）与VLRB+淋巴细胞存在共定位现象。同时，P38MAPK在混合菌免疫后还出现了入核的现象。以上实验结果表明，Lja-MAPK14和Lja-MAPK11参与了无颌类脊椎动物七鳃鳗的免疫应答过程。我们的研究为进一步研究P38MAPK在七鳃鳗的淋巴细胞信号转导途径中的作用奠定了基础。I关键词:日本七鳃鳗；MAPK14;MAPK11;分子克隆；系统发育；免疫应答IIMolecularCloning,RecombinantExpression

6、andRelatedImmunologystudiesofMitogen-activatedProteinKinaseP38αandβAbstractP38MAPKisasubclassoftheMAPKfamilyandplaysaveryimportantroleincellsignaltransductionintheimmuneresponseofhighervertebrates.Sofar,mostofthestudiesonP38MAPKhavebeendirectedatmammals,anditisunclearwhetherthereis

7、P38MAPKanditsfunctioninjawlessvertebrates.Sincelampreyisnotonlyanimportantrepresentativeoftheexistingjawlessvertebrates,itisalsoanimportantgroupofinvertebratesthathavethesignificanceofinitiatingtheevolutionofvertebrates.Therefore,thispaperchoosesP38MAPKastheresearchobjecttoexplorew

8、hetherP38MAPKexistsinlampr