七鳃鳗富含半胱氨酸分泌蛋白基因的克隆、表达及生物学功能的研究

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1、分类号：密级；学校代码：学号：遣宰师耗大学10165201111210硕士学位论文七鳃鳗富含半胱氨酸分泌蛋白基因的克隆、表达及生物学功能的研究作者姓名：学科、专业：研究方向：导师姓名：刘宇细胞生物学2014年05月学位论文独创性声明本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均己在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：童』宝学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大

2、学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。一·h学位论文作者签名：剑红指导教师签名：锄乡●签名日期：,．)oIV-年F月四Et辽宁师范大学硕士学位论文摘要富含半胱氨酸分泌蛋白(Cysteine—richsecretoryproteins，CRISPs)广泛分布于

3、哺乳动物和非哺乳动物的组织中，在精子成熟、精卵融合、免疫防御，以及离子通道的调控等方面发挥重要作用。此外，CRISPs家族成员还在临床疾病的检测预防以及治疗等方面也显示出良好的应用前景。七鳃鳗(Lampreys)是低等的无颌类脊椎动物，能够攻击海洋中的大型鱼类，具有吸血习性。本实验室在七鳃鳗的口腔腺中发现了一种新的富含半胱氨酸分泌蛋白家族成员(Cysteine—richbuccalglandprotein，CRBGP)。目前，相关于CRISPs家族成员的研究主要集中在哺乳动物和爬行动物，而七鳃鳗CRISP的生物学功能研究甚少。长久以来，

4、七鳃鳗由于其独特的历史进化地位因而被用于研究脊椎动物的系统发育与进化。通过实时定量PCR检测结果发现，七鳃鳗CRBGP(Lamprey．CRBGP，工．C船卯)广泛分布于七鳃鳗的心脏、口腔腺、肾脏、白细胞、鳃、肝脏和肠等组织中。经LPS抗原刺激后，L．CRBGP在七鳃鳗的心脏、口腔腺和肾脏中的表达水平明显发生上调。这提示三一C朐GP可能与七鳃鳗的营养摄取和免疫逃逸等生理过程密切相关。将七鳃鳗L—CRBGP基因构建入pGEX-4T．1原核表达载体，经IPTG诱导后在E．coliRosetta中成功表达出可溶性的重组蛋白CImGP(reco

5、mbinantL—cR占6-P，rL—CRBGP)。采用GST亲和层析法获得大量电泳纯的rL—CRBGP，分子量约为51．6kDa。此外，采用凝胶过滤层析从七鳃鳗口腔腺的分泌液中纯化出天然的CRBGP。体外实验结果表明七鳃鳗天然CRBGP和rL．CRBGP均具有抗氧化活性。MTT结果表明，天然CRBGP和rL．CRBGP蛋白均能抑制HUVEC和Hela细胞的增殖，但rL．CI强GP蛋白的抑制效果并不明显。这可能是由于重组蛋白时所选用的原核表达载体pGEX-4T—l无法对重组蛋白进行翻译后修饰而造成的。Transwell实验结果表明七鳃鳗

6、天然CImGP蛋白能够抑制HUVEC和Hela细胞的迁移和侵袭过程，诱导Hela细胞发生凋亡，抑制体内鸡胚尿囊膜新生血管的形成，表明七鳃鳗CRBGP具有抗血管新生的活性。对七鳃鳗CRBGP抗血管新生活性和作用机制的深入研究，不仅有助于阐明CRBGP在七鳃鳗中的生理功能，还为今后开发新型抗血管新生药物奠定了坚实的理论基础。关键词：七鳃鳗；口腔腺；t含半胱氨酸分泌蛋白；抗氧化活性；抗血管新生活性七鳃鳗富含半胱氨酸分泌蛋白基因的克隆、表达及生物学功能的研究TheCloning，ExpressionandAnti-angiogenicactiv

7、ityofanovelcysteine-richsecretoryproteinfromthebuccalglandofLampetrajaponicaAbstractCysteine-richsecretoryprotein(CRISP)whichiSwidelydistributedinmammalianandnon-mammalianplaysimportantrolesinspermmaturation，sperm-eggfusion，immunedefense．andionchannelsregulation．Inadditi

8、on，itiSalsoagoodmarkerforthedetectionandpreventionofclinicaldiseases．Lampreysareoneofthemostprimitiveja