日本七鳃鳗Lja-SHP2分子的克隆、重组表达以及相关免疫学研究

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1、分类号：学校代码：10165密级：学号：201511000900硕士学位论文日本七鳃鳗Lja-SHP2分子的克隆、重组表达以及相关免疫学研究作者姓名：渠成名学科、专业：遗传学研究方向：动物分子遗传导师姓名：刘欣教授2018年4月摘要SHP2是一种蛋白酪氨酸磷酸酶，由ptpn11基因编码，调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究多以哺乳动物为实验对象，在低等脊椎动物的研究比较少，本文以无颌类脊椎动物七鳃鳗为实验对象，甄选并克隆与高等脊椎动物SHP2同源的分子，研究SHP2分子在七鳃鳗免疫应答过程中的作用，搞清SHP2分子家族的系统发生，为探

2、索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。通过在日本七鳃鳗（Lampetrajaponica）转录组数据库中搜索SHP2基因的同源序列，根据Primer5软件设计扩增引物，利用嵌套法PCR技术成功克隆出七鳃鳗SHP2分子（Lja-SHP2）的完整开放阅读框（ORF），Lja-SHP2的ORF序列共有1761bp，编码587个氨基酸的蛋白质。多重序列比对显示，七鳃鳗的Lja-SHP2分子与其他高等脊椎动物从鱼类到哺乳类的SHP2分子都有大于65%的序列一致性而与其他高等脊椎动物的SHP1分子有不到60%的序列一致性。通

3、过构建各个纲代表动物的SHP1和SHP2分子的系统发育关系进化树发现，Lja-SHP2分子与高等脊椎动物的SHP2分子聚类于同一个大聚类群，而高等脊椎动物的SHP1分子聚类于另一个大聚类群。另外，在其它种类七鳃鳗基因组数据库中均没有找到SHP1分子的同源分子。以上结果说明，SHP分子家族在无颌类脊椎动物中尚没有分化成SHP1和SHP2分子。在Lja-SHP2基因序列的两端插入酶切位点，使其与pET-32a(+)载体相连，转化导入E.coliRosstte感受态细胞中进行表达，得到纯化的Lja-SHP2可溶性重组蛋白(rLja-SHP2)。以

4、重组蛋白rLja-SHP2为抗原，免疫新西兰兔（Oryctolaguscuniculus）制备多克隆抗体。通过ELISA分析，第四次加强免疫后，抗体的效价能达到1:256000，纯化的抗体经Weastenblot实验检测对rLja-SHP2以及天然蛋白都有较强的特异性。将副溶血弧菌和嗜水气单胞菌制成灭活混合疫苗免疫健康的七鳃鳗，加强免疫两次后利用PCR技术检测Lja-SHP2的表达量；在免疫Lja-SHP2的mRNA在白细胞、鳃和髓各个组织中均有表达；在用混合菌免疫刺激后，Lja-SHP2的表达在白细胞中没有显著差异，在髓组织中有不显著的下

5、调，而在鳃组织中的表达有显著性上调（p<0.05）。说明Lja-SHP2在免疫刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应，推测与VLRA免疫细胞的激活成正相关。利用siRNA干扰技术对Lja-SHP2分子进行了体内干扰敲低实验，结果表明所设计的3组siRNA混合物能在免疫激活七鳃鳗12、24h时间点有效敲低Lja-SHP2分子mRNA的转录，但36h后阻遏作用有所降低，至48h后基本恢复正常。此结果为后续深入探索Lja-SHP2分子的功能奠定基础。关键词：日本七鳃鳗；Lja-SHP2；抗体制备；免疫应答ICloning,RecombinantEx

6、pressionandRelatedImmunologyofLja-SHP2inJapanesePansyAbstractSHP2isaproteintyrosinephosphataseencodedbytheptpn11genethatregulatessignaltransductioninavarietyofsignalingpathwaysinthebody.Inthepast,mammalsweremostlyusedasexperimentalsubjects,andtherewerefewstudiesinlowervert

7、ebrates.Thispaperusedthenon-jawvertebratehermitesasexperimentalsubjectstoselectandclonemoleculesthatarehomologoustothehighervertebrateSHP2,andtostudySHP2molecules.Intheprocessoftheimmuneresponseoftheseaslugs,itisclearthatthephylogenetictreeoftheSHP2molecularfamilyprovidess

8、omecluesforexploringtheearlyoccurrenceandevolutionoftheadaptiveimmunesysteminhigherverteb