HLAE基因的研究及在alloHSCT后供受者细胞嵌合定量中的应用

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1、中山大学硕士学位论文HLA-E基因的研究及在allo-HSCT后供受者细胞嵌合定量中的应用姓名：甄子俊申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：方建培2003.5.28摘要HLA-E基因的研究及在allo—HSCT后供受者细胞嵌合定量中的应用硕士研究生：导耀：甄子俊方建蝰教授中山文学附属第二医院儿科摘要ff嚣蔫，造巍干鬃藤移檀嚣缮至§广泛应爰，尤其凌渗疗盘滚系统鬈性疾病、遗传／代＼谢性疾病、先天性免疫缺陷、自身免疫疾病等有无可蛰代的优势。虽然在造皿干细胞移植领域已取褥很大迸蔽，毽与移植有关的菜些问题仍未得到裔效的解决，如移植物穗入

2、后继发排斥、移植物抗宿主瘸(GVHD)防治困难、免疫重建缓慢、恶性病的复发等。GVHD娥异基因造血干细胞移植(allo．HSCT)中最主要的移植并发症，影响移植成功攀。在HLA全攘合(供受者间HLA-A，．B，．DR一致)的aUo．HSCT痰例中，ll级或II级以上的急性GVHD的发生率仍有23％，慢性GVHD达50％，提示可能有HLA系统獒毽撬骚分子参与移檀免疫应答。监终，，陌孕妇女对HLA半摇会夔黪，b产生兔疫耐受，且胎盘组织高水平表达HLA-E及-G等免疫抑制分子，提示人类器官移植有可能跨越}{毛A懿鼯碍。嚣魏，对HLA-

3、E及《等燕熹戆磷究基逐渐被重褫。HLA．E怒第一个被发现的非典型HLAI类分子，其结构及表达与经典型HLAI类(HLAIa)分子差剐较大，攘示HLA．E可能其有与HLAIa分子截然不同瀚功能。在allo．HSCT中，HLA—E可能激活NK．CTL介导宿主抗穆植物(HVG)成移植物抗宿主瘸(GVHD)，在移植免疫中具有至关重疆的作用。对HLA—E的研究为许多与免疫有关的领域开拓了广阕的视野。HLA．E纂因的研究方法很多，有限制性片段长度多态(RFLP)法、单链构象多态蛙(SSCP)法、壹按测彦法、蹶痒姆异性雾挨彗酸搽针杂交(SSO

4、P)法等。峦于其窍各种备样的缺点，故限制了它们的应用。有必羼建立简便、特异的方法，用于HLA—E蕊因懿礴究。研究表明，移植后的垡霪垄墅嵌合情况与造血干细胞移植的一系列问题如GVHD、HVG、GVL等也密切相关，嵌合定滚分丰厅辩指导稿床研究舆有重要意义。嵌合分析方法较多，但在个体识别能力、敏感性、准确性或普遍性等方蕊存在～些不足。故有必要建立一种准确、敏感、实用的方法以满足嵌合分析的需要。灏然HLA—E基因多摘要态性有限，但仍然有一定的个体识别力。HLA—E基因与HLAIa极少连锁不平衡，不受供受者间HLA全相合(HLA—A，一B

5、，一DR一致)的影响，因而可用于嵌合分析。有人用PCR．SSP对器官移植后供者造血细胞微嵌合作定性分析，特异性强，敏感度高。但未见PCR．SSP、嵌合定量分析的报道。I∥—7纠，l(：Jj本研究建立PCR-SSP方法，用于对HLA—E基因作准确分型。分析广东人群HLA—E基因的分布，并对HLA—E基因与移植免疫的关系作初步探讨。建立定量检测HLA—E基因作嵌合分析的方法，并对嵌合与移植后排斥、GVHD、免疫重建等问题的关系作分析。／本研究分两部分。第一部分：HLA—E基因的多态性分析及与移植免疫关系的初步探f讨。、包括PCR—S

6、SP检测HLA—E基因方法的建立；用PCR—SSP方法作广东地区汉族正常人群HLA—E基因多态性分析；检测接受a1]o—HSCT的小儿的HLA—E基因型，对HLA—E基因与移植免疫的关系作初步探讨。第二部分：HLA—E基因在a]lo—HSCT后供受者细胞嵌合定量中的应用。包括用PCR—SSP扩增HLA—E基因，建立allo—HSCT后供受者细胞嵌合的定量方法；用本实验建立的嵌合定量方法对接受allo—HSCT的病人在移植后不同时点检测嵌合体内供、受者源细胞比例，同时分析嵌合比例变化与预处理方案、GVHD、移植后免疫重建、恶性疾病

7、复发等问题的关系。第一部分：HLA-E基因的多态性分析及与移植免疫关系的初步探讨研究目的1．建立PCR—SSP方法检测HLA—E基因。2．用PCR—SSP方法作广东地区汉族正常人群HLA—E基因多态性分析。3．检测接受allo-HSCT的小儿的HLA—E基因型，对HLA—E基因与移植免疫的关系作初步探讨。实验对象和方法1．实验对象1．1．HLA—E标准DNA，用于PCR—SSP检测HLA—E基因方法的建立。1．2广东汉族无血缘相关的健康d,Jl,#b周血，用于HLA—E基因多态性分析。1．3接受异基因造血干细胞移植的小儿，移植前

8、供者及受者取外周血，用于HLA—E基因与移植免疫关系的探讨。2．实验方法2．1．用PCR—SSP方法检测HLA—E标准DNA，同时设立阳性对照及阴性对照，检测结果与2摘要标准DNA的已知HLA—E基因型对照，比较方法的准确性。同一标本反复检测5次，检验方法的重复