分泌型iga嵌合抗体基因的构建及在cho细胞中的表达研究

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1、新疆农业大学硕士学位论文分泌型IgA嵌合抗体基因的构建及在CHO细胞中的表达研究姓名：张宝中申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：冉多良20090601分泌型IgA嵌合抗体基因的构建及在CHO细胞中的表达研究摘要分泌型IgA(SIgA)是人体粘膜表面的主要抗体，是抵御病原体侵袭的第一道免疫防线。目前为止尚没有人尝试在动物呼吸道或消化道使用分泌型lgA阻断HSNl病毒的感染。由于禽流感的感染途径主要是呼吸道或消化道，呼吸道或消化道SlgA极有可能在病毒感染的最初阶段产生最好的保护效果。本研究选择在中国仓鼠卵巢(chin

2、esehamsterovary,CliO)细胞中表达具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗体，尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。采用本实验室建立的“基冈组DNA剪接(OenomicDNASplicing，GDS)”技术，根据已发表的人I口、plgR和IGHA的核苷酸序列，通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物，从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列；然后人工设计融合相邻外显子的融合引物，采用重叠PCR技术，把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列，完成基冈组DNA的体外剪接，扩增的PCR产

3、物纯化后克隆到pGEMoTEasyVector中。序列分析表明，GDS技术扩增的IgJ、plgR和IGHA基因与GenBank中的目标基因序列完全一致，其中IGHA为IgA2恒定区的序列。从分泌抗禽流感H5N1．HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA，应用RT-PCR扩增VK和VH基冈及信号肽序列，PCR产物克隆到pMDl8-T载体上进行序列分析，经分析为小鼠免疫球蛋白基冈，重链可变区共有414个碱基，前57个核苜酸编码19个氨基酸前导序列，其VH属于IgHVI家族，D段来自IgHVIV家族，J段来自IgHVII家族；轻

4、链可变区共有393个碱基，前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列，V段为IgKVIII家族，J段为IgKJI家族。通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接，VK基因与人CK连接，完成了人／鼠嵌合IgA抗体基因的构建。将人／鼠嵌合19A抗体重、轻链基因分别克隆剑以CMV早期启动子引导，以二氢叶酸还原酶基因(DI-IFR)乖U新霉素抗性基冈(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将l酣、plgR基因克隆剑以CMV早期启动子引导，以新霉素抗性基因仆吧0)为筛选标记pcDNA3．1(+)中。同时通过“质粒快

5、速定带点突变”技术将pcDNA3．1(+)-plgR中多聚免疫球蛋白受体基因胞内区突变掉，从而完成人分泌成分(secretorycomponent，SC)的真核表达载体构建。用构建的pEFolGHA9和pEF-IGIC0表达质粒转染CHO／dhfr细胞，经选择培养基(无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)筛选，挑取阳性克隆．I{jMTX加压进一步提高表达量。对此细胞株扩大培养并纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体，用专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白L亲和层析柱从含有牛血清的CHO细胞培养上清中纯化重组人源抗H5N1．HAIgA

6、抗体，并进行免疫学特性的分析。同时将构建的pEF-IGHA9、pEF-IGK9、pcDNA3．1(+)-sc和pcDNA3．1“_卜I硝表达质粒瞬时共转染CHO／dhfr‘细胞，培养48．72h的细胞上清，使刚ELISA检测嵌合SlgA抗体各组分的分泌情况。综上所述，本研究成功克隆了人IGHA2、IGI和plgR／SC基冈以及抗H5N1病毒中和性单抗的V区基因，并对该V区基冈序列进行胚系基因片段的分析；获得了完整人-鼠嵌合lgA抗体基冈：构建了重组SIgA各相关基因的表达载体；通过转染CHO细胞，初步获得了嵌合IgA和SI

7、gA抗体。关键词：禽流感病毒；嵌合SlgA抗体；中国仓鼠卵巢细胞；基因表达ConstructionchimericSecretoryImmunoglobulinAantibodygeneanditsexpressioninHamsterOvaryCellsAbstractImmunoglobulinA(19A)，astheprincipalantibodyclassinthesecretionsthatbathethemueosalsurfaces，actsasthefirstlineofdefence．Sofarther

8、eisnoattemptusingsecretoryIgAagainstHSNlvirusinanimalrespiratorytractordigestivetract．InthisstudyweusedChinesehamsterovary(CHO)cellstoexpressananti-H5N1