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1、HBV／HAV复合抗原基因在CHO细胞中的表达中国兽医2005年5月第25卷第3期Chin.,SciMay2005Vo1.250.3273HBV/HAV复合抗原基因在CHO细胞中的表达万家余,张玉静,张蕾,韩烨,高建邦,孙博兴,肖安东(吉林大学畜牧兽医学院,占林K,ff-130062)摘要:为探讨HBV/HAV复合疫苗的可行性,利用DNA重组技术将HBsAg与HAw复合多表位抗原基因V1X进行融合,插入到真核表达质粒pVAX1多克隆位点,构建成核酸表达疫苗pVAX1/SVPX,将其转染cH()细胞.转染细胞培养48h后,进行RT
2、PCR,Westernblot,E11SA分析,结果表明HBV/HAV复合抗原基因SVPX能够在CH()细胞内转录,表达,融合蛋白具有HBV和HAV抗原的特性.关键词:HBV;HAV;CHO细胞;核酸疫苗中图分类号:$852.65;Q78文献标识码:A文章编号:10054545(2005)030273—03DNA免疫是将编码某种蛋白抗原基因的真核表达质粒直接接种机体,被体细胞摄取并表达相应抗原,进而激发特异性CT1应答及特异性抗体的产生.因此,HBsAgDNA疫苗被认为是一种极具发展潜力的第3代疫苗,DNA疫苗已经在许多疾病的治
3、疗和预防方面显示出广泛的应用前景.近年来,国内外学者对乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus,HAV)DNA疫苗进行了大量的研究,但是对这2种病毒的双价DNA疫苗研究较少.本试验将乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg)基因与具有良好甲型肝炎免疫特异性的复合多表位抗原VPX基因融合在一起,亚克隆于卡那霉素抗性真核表达载体pVAX1巨细胞病毒(cMV)启动子下游的多克隆位点,构建成重组真核表达质粒pVAX1/SVPX
4、,并在体外进行初步表达及检测,旨在探讨HBV/HAV双价I)NA疫苗的可行性.1材料与方法1.1质粒,菌种,细胞克隆载体pMI)l8-T,购自TaKaRa公司;表达载体pVAX1,E.coliDH5a,CH()(Chinesehamsterovarycells)细胞,均为本教研室保存.1.2主要试剂ExTaq酶,TDNA连接酶,限制性内切酶,DNAMarker为TaKaRa公司产品;I)NA回收试剂盒,小牛血清,胰酶等,购自长春宝泰克公司;脂质体转染试剂Lipofectamine为G1BCO公司产品;乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂
5、盒(酶联免疫法),购自华美生物工程公司,兔抗HBV/HAV多克隆抗体,本教研室保存;辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG,购自Sigma公司.1.3重组PCR引物设计含有HBVadr亚型S基因的质粒pBI121S和含有HAV的复合多表位抗原基因VPX质粒pMD18-T/VPX,本教研室保存.根据s基因及VPX基因的核苷酸序列设计如下4条重组PCR引物.P1:5'一CCGGAATTCCACCATGGAGAACACAACATCAGGAT一3P2:
6、_GCG(ATCCAGATCCTGAACCAATGTATACCCAAAGACAAA一3P3:
7、5一TTGGTTCAGGATCTGGAT('C(CTTCTATTTGTCAGATGTT一3P,I:5
8、_CCGCTC(AGCTATATACCAA(:TT(GGGATCT收稿日期:20040908基金项目:网家亡】然科基金资助项【1(30471284)作者简介:万家余(1973一),男,博士.G3其中,P1/P2扩增合成s基因,P3/P4扩增合成VPX基因,然后P1/P4扩增合成SVPX,Pl,P4划线部分为便于克隆分别引入的EcoRI/XhoI酶切位点.S基因和VPX中间加了GSGSGS的linker;由于表达载体pVAX1足非
9、融合载体,因此在插入序列中必需包含一段Kozak翻译起始序列和1个起始密码子(ATG)以引导正确的翻译,在插入序列中还必需包括1个终止密码子以正确终止基因.1.4SVPX重组PCR产物的扩增,克隆和测序鉴定首先分别以pBI121/S,pMD18T/VPX质粒为模板,用P1/P2和P3/P4等2对引物分别扩增SVPX的5端片段s和3端片段VPX.将PCR产物s和VPX分别纯化回收,以纯化回收的s和VPX等摩尔数的混合物为模板,以P1和P4为引物,扩增SVPX融合基因.其中S片段和VPX片段PCR反应条件为:95(,变性4min;9
10、5C30S,55(,1min,72(,1min,30个循环;72C10min延伸.再用同样的PCR条件30个循环扩增SVPX,经酶切鉴定后,用DNA片段纯化回收试剂盒进行纯化回收,再将纯化回收的SVPX片段克隆到pMD18-T载体上,得到含有SVPX基因片段的质
