汉族人MBL全长基因在CHO细胞中的表达

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1、硕士学位论文汉族人MBL全长基因在CHO细胞中的表达硕士研究生：赖钦涛指导老师：陈政良摘要甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)属于哺乳动物C型凝集素超家族中胶凝素家族成员，在血清中多以寡聚体形式存在，一般认为四聚体以上的高寡聚体才具有生物学活性。MBL通过其糖识别域(carbohydrate．recognitiondomain，CRD)识别病原体表面以甘露糖、岩藻糖、N．乙酰葡糖胺、N．乙酰甘露糖胺等为末端糖基的糖结构，业已证明其能结合A组乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌，奈氏脑膜炎球菌、肺炎衣原体、甲型流感病毒、HIV、白色念珠菌、小球隐孢子

2、虫等多种病原体，激活凝集素补体途径并介导调理吞噬作用，发挥抗感染天然免疫效应。因此，MBL被认为是天然免疫系统中重要的模式识别分子之一。血清MBL水平低下和功能缺陷与多种病原体反复感染、妇女习惯性流产、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等疾病相关，引起MBL缺陷的主要原因是MBL基因的点突变。已发现，位于MBL结构基因主要的3个点突变可引起MBL缺陷，它们分别是CGT52T(订、GGC54GAC和GGA57GAA，均位于MBL基因外显子l，这3个点突变为常染色体显性遗传，其相应的基因型分别为D、B、C型，而野生型为A型。在普通人群中，MBL基因突变的频率非常高，MBL缺陷

3、成为最常见的免疫缺陷病之一，由此MBL补充治疗也呼之欲出。血浆纯化的天然MBL补充治疗已有文献报道，并且已通过了临床一期试验，结果喜人。但存在的问题是人血浆中MBL含量极低，提取的成本过高，来源受限于血液供应，同时避免不了一般血制品的缺点如潜在的HCV、HIV等病毒污染。此外，应用于科研时由于血液成分复杂，难于提取高纯度中文摘要MBL，使得对MBL生物功能的研究难度加大。因此，体外制各大量与天然MBL结构功能相近的重组蛋白意义重大，研究MBL基因表达的调控亦显同样重要。本课题组曾克隆了我国汉族人MBL的eDNA即MBL的编码序列，并在哺乳细胞中进行了该基因的表达研究，但表达效率和所

4、表达蛋白的寡聚体组分尚欠满意。鉴于基因内含子等非编码序列对蛋白表达有调节作用，本实验尝试体外表达MBL全长基因。I．汉族人MBL全长基因的克隆和序列分析采用mal=111Kn包被以捕获血清MBL、以抗人MBL抗体(HYBl31．11)检测的ELISA体系检测血清MBL水平。血样来自8例无反复感染病史和自身免疫病病史的成年健康汉族人个体，每样本按1：2、1：4、1：8稀释，每稀释度3复孔进行检测，检测结果应用SPSSl3．0软件按两因素多水平重复测量方法进行统计分析，筛选出血清MBL水平较高的血样用于提取白细胞基因组DNA。以其为模板，设计引物，应用PlatinumTaq酶进行高保真

5、PCR扩增MBL全长基因，并采用用pCR@．XL．TOPO载体进行TA克隆，构建了质粒pXL—MBL。小量提取质粒经酶切、PCR鉴定后送Invitrogen公司测序。ELISA结果显示OD450mn值随稀释度的增加而递减(F=99．351，P

6、4195146--54201466)比较，有17个碱基不同：其中仅1个位于编码区(外显子4)，即MBL基因的第3195位碱基，导致第126位密码子改变(CTC—CTG)，但它们的编码产物均为亮氨酸，且该位置碱基恰与GenBank收录的人MBLeDNA(AH006353)一致；其它不一致的碱基均位于内含子或外显子的非编码区。这说明我们成功克隆了A型MBL基因全长，构建了重组质粒pXL．MBL。Ⅱ硕士学,g-／仑文2．MBL基因真核表达质粒的构建根据pXL-MBL、pcDNA3．1(一)和pCI-neo的不同酶切谱，采用不同的内切酶，构建MBL基因重组真核表达质粒。(1)pcDNA3．

7、I(-)-MBL的构建：用gpnI和Not1分别双酶切载体pcDNA3．1(-)和质粒pXL—MBL，凝胶回收载体片段和目的基因片段，用T4ligase进行连接反应，产物转化宿主菌TOPl0F’。氨苄青霉素筛选出阳性转化菌并扩大培养，小量提取质粒，对所构建的重组质粒予酶切、PCR和测序鉴定。结果显示A型MBL基因全长以正向连入载体pcDNA3．1(．)，成功构建了重组表达质粒pcDNA3．1(-)-MBL。(2)pCI--MBL的构建：先用M／uI和SmaI完全酶切质