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1、37Glu突变型MBL蛋白在CHO细胞中的表达及其生物学特性研究作者：李瑞芳,赵娜,刘凤玲,张丽芸,陈政良【摘要】 目的:探索甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制。方法:采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因,构建重组真核表达载体,电转染CHO细胞,以Zeocin筛选并克隆化培养,用mAb-Sepharose4B和Ni2+-NTAagarose层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Westernblot、ELISA、配体结合试验、C4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果:重组真核表达载体pc
2、DNA4/HisMaxC-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37Glu突变型MBL蛋白主要以双链（Mr约60000）存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统。结论:GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白,进而影响其识别功能和效应功能。【关键词】甘露聚糖结合凝集素GGA57GAA突变体37Glu突变型蛋白识别功能效应功能 甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin,MBL）是肝细胞分泌的血浆蛋白,为C型凝集素超家族中胶凝素家
3、族成员［1］。MBL的糖识别域（carbohydrate-recognitiondomain,CRD）是其识别功能区,可选择性识别多种病原体表面以Man、ManNAc、GlcNAc等为末端糖基的糖结构;胶原样区（collagen-likeregion,CLR）为其效应功能区,通过与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBLassociatedserineprotease,MASP）相互作用,激活补体凝集素途径,发挥溶菌和调理功能,还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1,2］。已发现3个可引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变,分别位于外显子1的第54、57
4、和52位密码:GGC54GAC和GGA57GAA,其编码产物Gly为Asp或Glu取代;CGT52TGT的编码产物Arg变为Cys。这些点突变为常染色体显性遗传,其基因频率GGC54GAC在欧亚人群中较高（≥0.11）,GGA57GAA在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）,而CGT52TGT在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3,4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现,其MBL基因点突变的频率多在0.1以上。显然,MBL缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此,阐明MBL基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型MBL基因
5、在COS7细胞中瞬时表达,证明MBL这些点突变不影响MBL蛋白的合成与分泌［5］;将CGT52TGT、GGC54GAC突变体基因在CHO细胞中稳定表达,发现32Cys和34Asp突变型MBL蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然MBL蛋白［6,7］。那么,GGA57GAA突变的影响是否同52、54位密码突变一样？本研究中,我们将GGA57GAA突变体基因在CHO细胞中稳定表达,并对37Glu突变MBL蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。 1材料和方法7 1.1材料含人GGA57GAAMBL突变体全长编码区基因的质粒pMBLm57［8］、重组野生型MB
6、L蛋白［9］、人血浆天然MBL蛋白［10］、重组人MASP2-N端蛋白以及抗人MBLCRD单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）、MBL缺陷型人血清（基因型为LYPB/LYPB）、质粒pcDNA4/HisMaxC和大肠杆菌TOP10F`为南方医科大学免疫学教研室构建、制备和保存。限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAmarker和逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。高相对分子量（Mr）和低Mr蛋白marker购自晶美公司。HRP-羊抗鼠IgG抗体购自鼎国公司。质粒小量快速抽提试剂盒和DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩
7、生物公司。RPMI1640培养基、新生牛血清和Zeocin购自Invitrogen公司。Ni2+-NTAAgarose购自Qiagen公司。抗人C4d单克隆抗体(mAb)购自Quedel公司。抗人MBLmAb［HYP131-11］购自Abcam公司。CNBr活化的Sepharose4B购自AmershamBiotech公司。抗HismAb购自TIANGENE公司。CentriconPlus-20超滤膜（Mrcut-off10000）购自Millipore公司。甘露聚糖购自Sigma公司。 1.2方法 1.2.1真核表达载体的构建与鉴定上游引物5′-CG
8、GGATCCATGTCCCTGTTTCCATCA-3′,含BamH
