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1、37Glu突变型MBL蛋白在CHO细胞中的表达及其生物学特性的论文【摘要】 目的:探索甘露聚糖结合凝集素（mbl）基因gga57gaa点突变引起免疫缺损的机制。方法:采用pcr从质粒pmblm57中扩增含gga57gaa点突变的mbl基因,构建重组真核表达载体,电转染cho细胞,以zeocin筛选并克隆化培养,用mab-sepharose4b和ni2+-ntaagarose层析纯化目的蛋白,以sds-page、axc-mblm57转染cho细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37glu突变型mbl蛋白主要以双
2、链（mr约60000）存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与masp-2n端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统。结论:gga57gaa点突变产生结构有缺陷的mbl蛋白,进而影响其识别功能和效应功能。【关键词】甘露聚糖结合凝集素gga57gaa突变体37glu突变型蛋白识别功能效应功能 甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin,mbl）是肝细胞分泌的血浆蛋白,为c型凝集素超家族中胶凝素家族成员［1］。mbl的糖识别域（carbohydrate-recognitiondomain
3、,crd）是其识别功能区,可选择性识别多种病原体表面以man、mannac、glac等为末端糖基的糖结构;胶原样区（collagen-likeregion,clr）为其效应功能区,通过与mbl相关丝氨酸蛋白酶（mblassociatedserineprotease,masp）相互作用,激活补体凝集素途径,发挥溶菌和调理功能,还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1,2］。.已发现3个可引起调理吞噬缺损的mbl结构基因点突变,分别位于外显子1的第54、57和52位密码:ggc54gac和gga57gaa,其编码产
4、物gly为asp或glu取代;cgt52tgt的编码产物arg变为cys。这些点突变为常染色体显性遗传,其基因频率ggc54gac在欧亚人群中较高（≥0.11）,gga57gaa在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）,而cgt52tgt在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3,4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现,其mbl基因点突变的频率多在0.1以上。显然,mbl缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此,阐明mbl基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型mbl基因在cos7细胞中瞬时表
5、达,证明mbl这些点突变不影响mbl蛋白的合成与分泌［5］;将cgt52tgt、ggc54gac突变体基因在cho细胞中稳定表达,发现32cys和34asp突变型mbl蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然mbl蛋白［6,7］。那么,gga57gaa突变的影响是否同52、54位密码突变一样？本研究中,我们将gga57gaa突变体基因在cho细胞中稳定表达,并对37glu突变mbl蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。 1材料和方法 1.1材料含人gga57gaambl突变体全长编码区基因的质粒pmblm57［8］、重
6、组野生型mbl蛋白［9］、人血浆天然mbl蛋白［10］、重组人masp2-n端蛋白以及抗人mblcrd单克隆抗体（monoclonalantibody,mab）、mbl缺陷型人血清（基因型为lypb/lypb）、质粒pcdna4/hismaxc和大肠杆菌top10f`为南方医科大学免疫学教研室构建、制备和保存。限制性内切酶、taqdna聚合酶、t4dna连接酶、dnamarker和逆转录试剂盒购自takara公司。高相对分子量（mr）和低mr蛋白marker购自晶美公司。hrp-羊抗鼠igg抗体购自鼎国公司。质粒小量快速
7、抽提试剂盒和dna小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物公司。rpmi1640培养基、新生牛血清和zeocin购自invitrogen公司。ni2+-ntaagarose购自qiagen公司。抗人c4d单克隆抗体(mab)购自quedel公司。抗人mblmab［hyp131-11］购自abcam公司。br活化的sepharose4b购自amershambiotech公司。抗hismab购自tiangene公司。centriconplus-20超滤膜（mrcut-off10000）购自millipore公司。甘露聚糖购自sig
8、ma公司。 1.2方法 1.2.1真核表达载体的构建与鉴定上游引物5′-cgggatccatgtccctgtttccatca-3′,含bamhⅰ酶切位点;下游引物5′-cggaattcactcacagacccttcagatagggaact-3′,含ecori酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pmblm57质粒为
