重组血小板糖蛋白ibα活性片段在cho细胞中表达的论文

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1、重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达的论文【摘要】目的：建立表达重组糖蛋白ibα活性片段（rgpibαh1v289）细胞株，并且纯化其表达产物，研究其生物学功能。方法：利用脂质体将含有编码gpibαh1v289的dna质粒pcmv3转染cho细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用sdspage和grgpibαh1v289重组产品。sdspage显示，纯化的重组片段主要在42kd处显一蛋白区带，sterovarycellsandfunctionofrebinantactivefragmentofglycopro

2、teinibαh1v289　　zhaoyiming,shaobojing,dongningzheng，shenfei，ruanchanggeng.　　jiangsuinstituteofhematology,thefirstaffiliatedhospitalofsoochoentrgpibαh1v289entethods:thechocellsidpcmv3includinggpibαh1v289dnabylipofectamine.therebinantfragmentatographycolumn.thep

3、urityandimmuneactivityofpurifiedproductsaveasuredgrebinantfragmentinculturesupernatantsperlitercouldbepurifiedatography.therebinantfragmentformedamainlaneatthepositionof42kdonoclonalantibodysz2byaventmuneactivityandbiologyactivity,canbeapotentialantithrombosisdrug

4、.　　［keysterovarycells；rebinantglycoproteinibα；express；purification　　在正常生理条件下，循环中的血小板彼此之间不会发生聚集或黏附于内皮细胞上。.当内皮细胞损伤后，vr143kd)和gpibβ(mr22kd)通过二硫键结合，再与gpix（mr20kd）通过非共价键连接［1］。血小板膜糖蛋白ib(gpib)是血小板膜上最主要的糖蛋白之一，gpib主要有两个功能：①vr42kd），rgpibαh1v289在cho细胞是高度糖基化且属于分泌型蛋白，因此在cho培养上清

5、液内能大规模地培养、生产和纯化，获得的产品以期能特异地抑制血液中v25由本室保存；质粒pcmv3(编码gpibαh1v289)由比利时deckmynh.教授惠赠［4］。　　1.1.2试剂抗人vynh.教授惠赠［6］；lipofectamine2000、dmem和g418为gibco公司产品；proteingsepharose4b亲和层析柱、br活化的sepharose4b凝胶和fplc为pharmacia公司产品；hybondc硝酸纤维素膜购自amersham公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺和瑞斯托霉素为sigma公司产品；

6、其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。　　1.2方法　　1.2.1cho细胞的转染和转基因工程细胞株的筛选［7］含编码gpibαh1v289dna质粒pcmv3经lipofectamine转染cho细胞后，以600mg/lg418，10%胎牛血清的dmem培养转染细胞以筛选抗性克隆，待抗药克隆长出后扩大培养。同时继续用600mg/lg418以筛选恒定表达的转染细胞，并检测上清液中rgpibαh1v289的表达量。　　1.2.2免疫放射法（ira）测定cho培养上清液中rgpibαh1v289的表达量用抗血小板gpibα单克隆

7、抗体sz2igg作为包被抗体10mg/l，100μl/孔，4℃过夜。第2天用pbs吐温20洗板3次，封闭后，每孔加入100μl细胞培养上清液，37℃反应2小时，同上洗板3次后，加入125i标记的抗血小板gpibα单克隆抗体2d4（125i2d4），每孔加入脉冲数1×105cpm/0.1ml，37℃反应1小时,同上洗涤6次后，在γ免疫计数仪上测定结合的脉冲数（cpm）。　　1.2.3cho工程细胞株克隆化及大批量培养g418筛选到阳性cho抗药克隆经检测确证分泌rgpibαh1v289蛋白后，以有限稀释法进行克隆化，

8、将克隆化生长状态良好、高表达rgpibαh1v289的细胞扩大培养，以5%小牛血清完全培养基37℃培养，收获上清-70℃保存备用。　　1.2.4rgpⅰbαh1v289表达产物的纯化收集表达rgpibαh1v289培养上清液，经超滤浓缩后又经sz2iggsepha