重组人凝血因子ⅷ(rhfⅷ)表达载体构建及在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中高效表达

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：颈表舒訇签字日期：加f多年学位论文版权使用授权书6月7日本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内

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3、防治主要依赖于反复给予病人由人血浆制备的FVIII。然而，临床上不仅人FVIII来源有限，而且病人还可能通过输入人FVIII时而导致血液传播性疾病如肝炎、HIV等的发生。因此，应用重组人凝血因子VIII(rhFVIII)治疗血友病则可避免上述问题。本课题旨在构建rhFVlII重组表达载体，通过瞬时转染CHO．dhfr-细胞获得高效表达的rhFVIII，从而为大规模生产rhFVIII提供实验理论依据和基础。材料和方法：pTriEx．4Neo载体是一多用途表达载体，它可分别用于细菌、昆虫及哺乳动物细胞的外源性基因的高效表达，它不仅带有筛选基因Neo用于稳定细胞系的建立，而其携带的His

4、．Tag、S．Tag、HSV．Tag等标签便于对目的蛋白的分离纯化。CHO细胞是一常用的外源蛋白表达的宿主细胞，它既可以贴壁生长，具有较高的耐受剪切力和渗透压的能力，又可进行悬浮培养或无血清培养有利于大规模生产。CHO—dh扩是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的细胞系，当成功转染含有DHFR的表达载体后，细胞可在不含鸟嘌呤及胸腺嘧啶的培养基中生长。此外，利用甲氨蝶呤(MⅨ)加压筛选，可以得到稳定表达外源蛋白的细胞系。我们首先将人FVIII全长序列，IRES和DHFR克隆至pTriEx．4Neo载体，然后采用聚乙烯亚胺(PEI)融合法将该载体转染CHO．dhfr-细胞进行瞬时高效表达，

5、最后利用rhFVIII特异性抗体(ELISA试剂盒)检测细胞rhFVIII的表达水平。结果与结论：我们成功地构建了重组质粒pTriEx一4一FVIII。IRES．DHFR高效表达载体，该载体采用PEI导入CHO．dhfr-细胞后实现了外源蛋白(FVIII)的瞬时表达，且经ELISA法检测到rhFVIII的表达水平为2．5ng／ml。本实验成功建立了一种由CHO．dbr细胞瞬时表达rhFVIII的方法，后续实验将试图建立稳定表达rhFVIII的CHO-dhfr-细胞株，从而为大规模制备rhFVⅢ奠定基础。关键词：rhFVlII；瞬时表达；CHO细胞AbstractABSTRACTob

6、jective：Anti—hemophilicFactorVIII(FVIII)isamacromolecularglycop-roteinofplasmawhichplaysanimportantroleinbloodcoagulation．LackofFVIIIleadstotypeIhemophilia．Atpresent．thepreventionandcureoftypeIhemophiliamainlydependsongivingpatientsFVIIIpreparedfromplasma，repeatedly．However,thesourceofFVIIIisl

7、imitedclinicallyandthepatientswhoareadministratedwithFVIIImayhaveariskforbeinginfectedwithhepatitis，HIVandotherbloodtransmitteddiseases．Therefore，applicationofrecombinanthumanfactorVIII(rhFVIII)forcuringhemophiliawillavoid也eaboveproblem