构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜_省略_fs25在cho细胞中的重组表达_陈勇

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1、药物生物技术12PharmaceuticalBiotechnology2013，20(1):012～016·研究论文·构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白pfs25在CHO细胞中的重组表达*陈勇，陆俭，李刚，雷清，蒋琳(国药集团兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃兰州730046)摘要构建一种可实现外源基因高效的、适用于中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞的质粒表达系统，并成功实现了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因在CHO细胞中的表达。新构建的真核表达载体是在pBudCE4.1质粒载体上改造获得的，被命名为pCMV-WD，包含了人工合成的、完整的弱化SV40启动子与二氢叶酸还原酶(DHFR)基

2、因组成的顺式表达元件和全新设计的多克隆位点，该载体属于CHO细胞通用载体，理论上可以实现任何外源基因在CHO细胞中的表达。基于该载体，采用定向克隆策略插入了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因，构建的重组表达质粒+为pfs25/pCMV-WD。经zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选，获得了DHFR基因阳性的细胞克隆。对表达量最高的克隆株进行亚克隆，并经MTX加压筛选以获得高表达pfs25蛋白的CHO细胞株。ELISA和WesternBlot结果表明，重组pfs25蛋白具有良好的免疫学反应性，且表达量为0.1mg/mL。该研究首次获得了可分泌重组pfs25蛋白的C

3、HO细胞株。关键词真核表达载体;CHO细胞;二氢叶酸还原酶;弱化SV40启动子;pfs25中图分类号Q812文献标志码A文章编号1005-8915(2013)01-012-05随着DNA重组技术的日臻完善和普及化，国内外已经用载体pCMV-WD。在中华仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvaryCells，CHO)中疟疾是疟原虫引起的、严重危害人类健康的虫媒性传表达了多种外源基因，但是，有工业生产价值的蛋白质并不染病。2008年全球有2.43亿临床病例，其中86.3万人因［2］多。与大肠杆菌相比，CHO细胞具有获得高表达细胞株所恶性疟疾死亡。在利用疫苗预防疟疾传播的策略中，传需

4、的时间长、细胞大规模培养的成本高等缺点，其中最重要播阻断性恶性疟疾疫苗是当前研究的热点。其中，子孢子［1］的缺点是目的蛋白质在CHO细胞的表达量不高。此外，囊表面膜蛋白pfs25是传播阻断型疟疾疫苗公认的侯选靶鉴于生物活性蛋白质用作药物时，巨大的商业价值，很多用抗原。美国NIH已经以pfs25蛋白质作为抗原制备的疫苗［3］于产生重组表达药用蛋白的真核表达系统和方法为国外大完成Ⅰ期临床试验。由于pfs25蛋白是结构复杂的糖蛋公司拥有，在生产实践领域均存在技术专利屏障。所以，构白质，已有的研究中多是通过酵母表达系统获得。相对于建具备自主知识产权的真核表达系统，对于制药企业实现酵母细胞，CH

5、O细胞在蛋白质翻译后修饰，尤其是糖基化药用蛋白质的工业化生产具有明显的基础性技术支撑作方面更接近天然状态，而相关的研究并未见报道。本研究用。本文以商业化的真核表达质粒pBudCE4.1作为母本载利用新构建的真核表达载体pCMV-WD成功克隆并在CHO体，利用基因重组技术对其进行了大量的改造。首先，参考细胞中实现了pfs25基因的表达，该研究为以后研制基于已有的研究，创新性地设计了弱化的SV40启动子与二氢叶pfs25蛋白质的恶性疟疾疫苗奠定了基础。酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)基因构成的完整1材料和方法的外源基因顺式表达元件，并将该表达元件替换了母本

6、载体中肽链延长因子基因启动子(EF-1α)及其多克隆位点。1.1材料其次，根据替换后的载体序列全新设计了新的多克隆位点真核表达质粒pBudCE4.1、Zeocin抗生素均购自序列，替代了母本载体巨细胞病毒早期启动子(CMV)下游Invitrogen公司;限制性核酸内切酶XhoI、XbaI、EcoRV、Pst的多克隆位点，从而形成了一种全新的基于CHO细胞的通I、BamHI、NheI、BstBI和pMD18-TSimpleVecter、T4DNA*收稿日期:2012-10-01修回日期:2012-11-24作者简介:陈勇(1972-)，男，副研究员，主要从事基因工程疫苗及分子生物学研究工

7、作。*通讯作者:蒋琳(1962-)，女，研究员，主要从事分子生物学及疫苗研发，E-mail:Jianglin620@sohu．com陈勇等:构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白pfs25在CHO细胞中的重组表达13连接酶、1kbDNAmarker、DL2000DNAmarker均购自cloningsite，MCS)，序列为:GATATCGCGGCCGCTCGAG-TaKaRa公司;TaqplusDNA聚合酶购自上海生工公司;质粒GTCGACGG