人重组riz1基因真核表达载体构建及其在te-13细胞中表达

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1、天津医科大学硕士学位论文人重组RIZ1基因真核表达载体的构建及其在TE--13细胞中的表达姓名：王硕申请学位级别：硕士专业：临床医学；外科学胸心外科指导教师：张鹏2012-05天津医科大学硕士学位论文目的：中文摘要构建人pcDNA3．1(+)／RIZl真核表达载体并转染人食管鳞状细胞癌TE-13细胞，观察RIZl在TE．13稳定细胞株中的表达。方法：1．用RT-PCR方法从人食管癌组织中提取tRNA。2．将从食管癌组织中提取的tRNA逆转录为eDNA。3．根据NCBI公布的ⅪZ1序列设计五对引物。4．从食管癌组织的cDNA中

2、对RIZl各段进jyPCR扩增。5．将扩增的PCR产物连入T载体，并测序。6．将测序正确的含PCR产物的质粒酶切后连／入．pcDNA3．1(+)真核表达载体。7．将连／入pcDNA3．I(+)的RIZl基因进行酶切鉴定并测序。8．复苏并培养人食管鳞状细胞癌TE．13细胞。9．提取pcDNA3．I(+)／RIZ1超纯质粒。10．将pcDNA3．I(+)／RIZl超纯质粒转染入人食管鳞状细胞癌TE．13细胞。11．Western．blotting鉴定pcDNA3．1(+)／PdZl在人食管鳞状细胞癌TE．13细胞中蛋白表达。结果

3、：1．PCR扩增产物129kL琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因条带大小约5157bp，与理论预期值一致。构建完成人重组RIZl真核表达载体pcDNA3．I(+)／RIZl，测序结果经BLAST七L对，与NCBI公布的RIZl序列完全一致。天津医科大学硕士学位论文2．Westernboltting检测显示，．转染pcDNA3．1(+)kRIZl的人食管鳞状细胞癌TE．13细胞中ⅪZ1蛋白获得表达。结论：成功构建人重组RIZl真核表达载体并转染人食管鳞状细胞癌TE．13细胞，转染细胞株中RIZl蛋白呈显著表达。关键词：视网膜母细胞瘤蛋

4、白结合锌指结构基因；pcDNA3．1(+)；RT-PCR；载体；蛋白表达；Western-blottingObjectipe：AbstractToconstructhumanRAZ1eukaryoticexpressionvectorsandtransfecthumanesophagealsquamouscellcarcinomaTE一13cells，andobservetheexpressionofRIZ1inTE．13cells．Methods：1．ExtracttRNAfromthehumanesophagealcar

5、cinomatissuesusingRT-PCRmethod．2．ReversetranscriptasetRNAextractedfromtheesophagealcarcinomatissuetocDNA．3．AccordingtotheRIZ1sequencereleasedbyNCBIdesign5primer．4．PCRamplificationfromthecDNAofesophagealcarcinoma．5．ConnectPCRproducttoTcartier，andsequencing．6．Connect

6、edplasmidwhichdigestedbyrestrictionenzymetopcDNA3．1(+)eukaryoticexpressionvector．7．RIZlwhichconnectedtopcDNA3．1(+)wasidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing．8．RecoverandcultivatehumanesophagealsquamouscellcarcinomaTE_13cells．9．ExtractpcDNA3．1(+)／RIZlult

7、rapureplasmid．10．PcDNA3．1(+)／砌Z1ultrapureplasmidwastransfectedintoTE-13．11．EvaluatetheproteinexpressionofpcDNA3．I(+)／RIZ1inhumanesophagealsquamouscellcarcinomaTE．13cellsusingwestern-blotting．ResuIt：1．DestinationgeneamplifiedbyPCRwasabout5157bpinlengthanalysedby129／

8、Lagarosegelelectrophoresis，whichmettheexpectancy．HumanrecombinantRIZ1eukaryoticexpressionplasmidvectorspcDNA3．I(+)／RIZ1wereconstructed，III天津医科大学硕