猪嵴病毒全基因组序列分析及荧光定量pcr检测方法的建立

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1、上海交通大学硕士学位论文猪嵴病毒全基因组序列分析及荧光定量PCR检测方法的建立学院：农业与生物学院学科专业：预防兽医学学号：1101509078作者：王长松指导教师：华修国教授日期：2013年1月万方数据DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterANALYSISOFTHEFULLGENOMEANDESTABLISHMENTOFFLORESCENCEQUANTITATIVEPCRDETECTIONOFPORCINEKOBUVIRUSAuthor：Changsong

2、WangAdvisor：ProfessorXiuguoHuaMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSchoolofAgricultureandBiologyShanghaiJiaoTongUniversityShanghai200240,ChinaJanuary,2013万方数据万方数据万方数据上海交通大学硕士学位论文猪嵴病毒全基因组序列分析及荧光定量PCR检测方法的建立摘要猪嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKoV)属微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，嵴病毒属（Kobuvirus），为单股正链RN

3、A病毒。虽然PKoV与猪群中临床症状的关系尚不确定，但是由于阳性率较高，可能与其他病毒一起发生混合感染而导致疾病。目前国内外针对猪嵴病毒的研究甚少，因此有必要对其进行相关基础研究。本文主要从PKoV流行病学调查、全基因组序列分析、荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用等方面进行，结果如下:根据GenBank上发表的PKoV全基因组序列，在3D保守区设计特异性引物，对上海周边地区采集的116份猪粪样品进行PCR检测。结果显示PKoV阳性率为38.8%(45/116)。在三个猪场（分别位于青浦区、闵行区和奉贤区）中，阳性率分别为46.7%(21/45)、35.

4、1%(13/37)和32.4%(11/34)，结果证实PKoV在上海周边地区猪群中广泛存在。利用SPSS13.0软件对实验统计结果进行分析，结果表明仔猪可能比育肥猪更容易感染PKoV，并且可能与腹泻有关。利用MEGA4.0软件进行系统进化分析，结果表明在上海地区PKoV存在基因多样性。根据已知的PKoV全基因组序列设计10对引物，进行全基因组序列扩增并进行序列分析。结果显示：病毒的基因组长度为8210nt,仅III万方数据上海交通大学硕士学位论文含有一个由7467个核苷酸组成的开放阅读框（openreadingframes,ORF），编码一个多聚蛋白为24

5、88aa。通过与参考毒株基因组序列Y-1-CH(GU292559)和S-1-HUN(EU787450)的比较，发现结构蛋白区比非结构蛋白区具有更多的基因突变。应用Simplot软件对PKoV进行全基因组序列的基因重组分析，结果表明该毒株可能发生了早期的部分基因重组，可能是PKoV基因多样性的一个重要基础。根据PKoV的全基因组序列设计引物，通过对反应条件的优化，建立了SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，并与常规RT-PCR检19测方法进行了比较。结果显示，在模板浓度7.02×10~7.02×10拷贝/μL范围内建立的标准曲线，荧光阈值（Ct）与其呈

6、现较好的线性关21系(r=0.9975)，融解曲线特异，检测灵敏度下限达7.02×10拷贝/μL，3而常规RT-PCR方法的检测下限为7.02×10拷贝/μL，重复性变异系数小（<1%）、稳定性高，能特异地检测PKoV，适合于PKoV感染的临床监测或流行病学调查等相关研究。对116份猪粪样品的检测结果进一步表明该方法（检出64份）比常规RT-PCR方法（检出45份）的灵敏度高。关键词：猪嵴病毒，流行病学调查，序列分析，荧光定量PCRIV万方数据上海交通大学硕士学位论文ANALYSISOFTHEFULLGENOMEANDESTABLISHMENTOFREAL

7、-TIMEPCRDETECTIONOFPORCINEKOBUVIRUSABSTRACTPicornavirusesaresmall,non-envelopedviruseswithasingle-stranded,positive-sensegenomicRNA.Porcinekobuvirus(PKoV)isamemberofthegennusKobuvirusofthefamilyPicornaviridae.AlthoughtherelationshipbetweenthePKoVandtheclinicalsymptomisunclear,theh

8、ighdetectionrateofPKoVinpigsacros