水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究

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1、分类号S墨!三：三UDC博士学位论文水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究王锦学科专业动物遣佳直独皇鏊殖指导教师互徨题班究虽论文答辩日期2013．匝一学位授予日期11IlllllllIHIIIIlllllll}llllllⅢY2406954广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本

2、人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。囵不保密。敝作者签名：≥诈日期．工良‘、陟指导教师签名：／叉00扔n卜乙／日期≯f岁．6．fj作者联系电话：馏冶fI岁钾y!电子邮箱：了★叼皇易f国f莎石’厶口叭·水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究摘要水牛是中

3、国南方极具开发潜力的主要家畜，具有耐粗饲、乳品品质好等优点。但由于我国本地水牛产奶性能低下，致使奶水牛产业的发展缓慢。因此，如何应用现代生物技术培育出高产奶量的水牛新品种是目前要解决的主要问题。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱，寻找差异表达基因，研究水牛的泌乳机制，并为培育高产奶量的转基因水牛提供丰富的候选基因素材；然后，探索转座子系统在水牛转基因中的应用，以期提高水牛转基因的效率；构建了乳腺特异性生长激素基因(GH)转基因表达载体，在乳腺细胞和乳腺组织中进行检测，分析外源GH基因的表达对乳蛋白等基因表达的影响；最后，采用随机整合、转座子主动整合等转基因

4、技术将重组GH基因导入水牛基因组，生产GH转基因的水牛胚胎，以期培育出高产奶量转基因水牛新品种。本研究取得的主要结果总结如下：1．水牛泌乳期与非泌乳期基因表达谱及差异表达分析。构建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱，分析差异表达和泌乳期高丰度表达的基因，探讨水牛泌乳的分子机制，也为转基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特异性表达启动子。基因表达谱序列拼接后获得114，014个单一的Unigenes，与牛的基因组信息比对注释了30290个基因，可以定位到270条相应的通路上(pathway)，其中与乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代谢通路相关基因表达丰度较高。在泌乳期乳腺组织中特异性表达

5、的基因有3053个，占到所有基因序列的2．68％。比较水牛乳腺两个时期基因表达量，泌乳期表达量上调的基因有1390个，下调的基因有5851个。在270条KEGG通路中有228个通路涉及到差异表达基因，如介导生长激素作用的JAK-STAT和MAPK信号通路。实时定量PCR(QRT-PCR)检测到水牛的非泌乳期乳腺组织中有少量的乳蛋白基因表达。1c酪蛋白(CN3)基因表达量在非泌乳期与泌乳期乳腺中都是显著高于其它基因。与非泌乳期相比，泌乳期乳腺CNlSl基因表达量增加了6958倍，CNl$2增加了4800倍，KCN和aLA增加了1000倍左右，而p酪蛋白增]JRT244倍，与测序

6、结果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺组织中检测到GHR,PRLR禾111GFlR的表达，说明GH、PRL和IGFl可能参与了泌乳的分子调控过程。2．水牛乳腺上皮细胞(BME)基因表达分析。通过PB转座子携带的LT抗原永生化诱导水牛乳腺上皮细胞(B垭)，建立检测乳腺转基因表达载体的细胞模型。PB转座子为骨架的永生化载体pXL—BACII—bCN2／LT转染后的BME细胞的腺泡消失速度和成纤维样转变降低。在添加催乳素诱导培养后，第30代的永生化处理的BME细胞能检测到乳蛋白基因的表达。其中CNlSl基因表达量为非泌乳期乳腺的88．32倍，CN3为32．09倍，CNlS2和乩A基因

7、表达量分别为2．8倍和3．3倍。结果表明，初步建立了细胞水平检测乳腺特异性表达载体的体外模型。3．水牛转座子转基因技术方法的建立。本研究通过构i童：piggyBac(PB)，passport(PP)和sleepingbeauty(SB)转座子转基因载体，转染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)，同时对转座子转基因系统进行优化，以期建立水牛转座子转基因技术体系。转座子转基因载体转染水牛的胎儿成纤维细胞(BFF)后，均能观察到标记基因EGFP的表达。应用p18T载体、PB、PP和SB转座子表达NEO基因，转染细胞后