水牛sry基因及胚胎性别鉴定技术的研究

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1、水牛SRY基因及胚胎性别鉴定技术的研究摘要本论文研究内容是水牛SRY基因和胚胎性别鉴定PCR体系的建立和优化。论文共分为两部分：第一部分，包括第一章和第二章，为文献综述部分；第二部分，包括第三章和第四章，为试验研究部分。第三章研究目的是通过对水牛SRY基因的克隆、序列分析及Southern杂交检测，为进一步研究SRY基因的作用机理和设计特异于水牛SRY基因的胚胎性别鉴定引物打下基础。根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物，PCR扩增后得到水牛SRY基因，测序后分析表明，该基因长度为2005bp，其中1～504bp为5’启动子区(Promoter)，1196～2005bp为3’侧翼序列(L

2、rrR)，505～1195bp为SRY的读码框(ORF)。将该基因序列提交到GenBank数据库(登录号为DQ417872)。BLAST比对显示，与牛属动物的同源性为95％～96％，其中HMG．box区的同源性高达99％，具有高度的进化保守性。使用ClustalX对水牛SRY基因外显子区域做多重比对分析后，构建部分哺乳动物系统进化树，与实际进化关系保持很好的一致。在SRY基因保守区设计探针，分别对雄性水牛和雌性水牛基因组进行Southern杂交，只在雄性水牛出现杂交信号，说明SRY基因为雄性特异。第四章研究目的是建立并优化水牛胚胎性别鉴定的PCR体系，以便该项技术能在生产中大规模应用

3、。根据第三章中水牛SRY基因核心序列设计两对特异于水牛的性别鉴定引物SAl／SA2、SBl／SB2，根据小鼠ZFX／ZFY基因和水牛G3PDH基因分别设计内参引物ZAl／ZA2、GAl／GA2。对不同T哺乳动物的DNA进行特异性检测和梯度浓度的公水牛DNA进行敏感性检测以筛选出最佳引物。分别使用煮沸法、蛋白酶K十Tween20法、Tween20+DTT法裂解胚胎样品，扩增雌雄共有的G3PDH基因，比较扩增结果筛选出最佳的胚胎裂解方法。结果显示，1)引物SBl／SB2、GAl／GA2扩增结果较好，分别作为检测引物和内参引物；2)三种处理方法的有效检出率分别为85．3％(29／34)、9

4、7．1％(33／34)和97．1％(33／34)，后两种处理方法的扩增效率高于煮沸法，为简化操作，选取DTT+Tween20法。对筛选出的引物SBl／SB2和GAl／GA2设计一对巢式引物SB3／SB4、GA3／GA4，建立多重巢式PCR体系，对不同M92+浓度、不同dNTPs浓度、不同引物浓度比例和不同循环数进行多次试验以优化多重巢式PCR反应体系。采用以上优化后PCR反应体系，对27枚水牛桑椹胚和24枚Y精子受精的IvF胚胎进行性别鉴定，并使用斑点杂交方法验证PCR扩增准确率，结果显示，1)多重巢式PCR体系中，Mgz+浓度为1．5mM，dNTPs浓度为100gM；引物SB3／S

5、B4、GB3／GB4浓度分别为0．5oM、0．25rtM时扩增效果较好，循环数以35为宜；2)27枚水牛桑椹胚可鉴定率为100％，雄性比例为51．9％(14／27)，雌-眭比例为48．1％(13／27)。斑点杂交结果表明扩增准确率为100％；3)Y精子受精胚胎鉴定结果中雄性比例为83．3％(20／24)。说明该PCR方法能够有效用于水牛胚胎性别鉴定。关键词水牛SRYPCRSouthern杂交胚胎性别鉴定斑点杂交IISTUDYONBUFFALOSRYGENEANDPRElMPLANTAT10NEMBRYOSEXlDENTlFICATIONABSTRACTThisthesisstudie

6、sissuesofbuffaloSRYgeneandPCRsystemforpreimplantationembryosexidentification．Itisarrangedintwoparts：partlincludeschapter1andchapter2，whichisareviewofliteratures；part2includeschapter3andchapter4，whichdealswiththeexperimentalworks．Theobjectivesofthesestudiesinchapter3weretoinvestigatetheoperation

7、mechanismofSRYgeneanddesignspecificprimersforbuffaloembryossexidentificationbycloning，sequencingandSouthernblotanalysisofSRYgene．SRYgenefromBuffalogenomewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PC鼬withprimersbasedonthesequenceofHoste