一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法

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1、一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法CN100334205C摘要一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法，利用屠宰场水牛卵巢回收卵母细胞，经体外成熟培养后，与经流式细胞仪分离的新鲜或冷冻的良种公牛的X或Y精子进行体外受精。受精卵在体外培养发育到囊胚期时回收胚胎冷冻保存待用于移植产生出期望性别的后代。本发明的优点是可使胚胎生产性别化及工厂化，从而加快高产奶水牛扩繁速度。权利要求(1)1.一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法，其特征是由下列步骤组成：(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于20～25℃无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室；从清洗干净

2、的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下选取卵母细胞，用收集液洗涤2～3次，再用成熟培养液洗涤一次；其中，卵母细胞收集液为20～30mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的、添加有2～8mmol/L碳酸氢钠、2～5％发情牛血清的TCM199；(2)将卵母细胞转入成熟培养液中，放入培养箱中进行成熟培养，培养时间为21～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO2的空气及最大的湿度；其中，成熟培养液为20～30mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的TCM199+3～8％发情牛血清+0.1μg/m

3、L促卵泡素+2～5％牛卵泡液；(3)将由流式细胞仪分离的新鲜或冷冻解冻的水牛X或Y精子，通过Percoll梯度离心将精液中死精子与活精子分开；其中，Percoll梯度离心是将精液放入2mL90％：2mL45％Percoll梯度的离心管中，700xg离心20分钟，弃上清，加入1mL受精液400xg离心5分钟；(4)将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精滴中；精子稀释后将X或Y精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养；其中，受精液为改进的台罗氏液培养液，添加有5～

4、15mg/mL牛血清白蛋自、20～50μl/mL青霉素胺、牛黄酸、肾上腺素混合液、2～7mM咖啡因、30～60μg/mL肝素，受精滴大小为15～30μl，每滴放入卵母细胞15～20枚，将精子加入到受精滴中，使精子浓度达2×106/mL，培养条件为39℃，5％CO2的空气及最大的湿度，培养时间为6～8小时；(5)体外受精培养6～8小时后，将受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有新生牛血清的牛颗粒细胞单层培养液中，放入培养箱中体外培养6～8天；其中，培养液为20～30mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲的TCM199

5、+5～15％新生牛血清+0.05～0.15mg/mL的丙酮酸钠，并用黄牛颗粒细胞作为单层，在39℃，5％CO2，5％O2及最大湿度条件下体外培养6～8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液；(6)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，将发育良好的优质胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存；其中，受精后第6、第7和第8天囊胚，是指具有囊胚腔和内细胞团的胚胎，包括早期囊胚、囊胚、正在扩张和已经扩张囊胚。说明一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法技术领域本发明属生物工程技术领域，特别涉及动物性别控制的方法。背景技术哺乳动物个

6、体的性别在精子和卵子受精时由不同的染色体重新分配和组合所决定。性别的遗传基础是依赖于精子细胞的表型，若携带X染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XX则发育为雌性；若携带Y染色体的精子与卵子结合，受精卵的染色体组合为XY则发育为雄性。用分离的X或Y精子给母畜人工授精或与卵母细胞体外受精，在受精之前便可预知后代的的性别，从而达到性别控制的目的。利用精子分离技术与体外受精相结合来生产动物后代，最早是在英国剑桥生物有限公司(ABC)展开的。Cran等(1993)是最早开展这一研究的人。他们把分离精子受精后产生的胚胎移植到9头

7、受体母牛，其中4头怀孕，并产下6头(3头母犊牛和3头公犊牛)预选性别的犊牛，性别准确率为100％。1995年，Cran等又进行了第二项研究，即用分离的Y精子生产雄性犊牛的实验。他们将由分离的Y精子进行IVF后获得的106枚胚胎冷冻后进行移植，共产下41头犊牛，其中37头为公犊牛，雄性比例为90％。除了牛的分离精子IVF的研究外，还有人进行了猪的分离精子IVF的研究，通过胚胎移植后成功地产下了仔猪。但用水牛的分离精子进行体外受精，目前国内外还未见有报道。水牛是我国南方的水牛奶具有很高的营养价值，但就目前我国奶水牛的现状看，其数

8、量和奶产量，还远远满足不了市场的需求。而通过生产可控性别胚胎的胚胎生产技术能迅速增加奶水牛头数，从而提高奶水牛的选择强度，这对加快奶水牛业的发展意义非常重大。本专利的发明者之一卢克焕博士、教授，是国际知名科学家，1988年在爱尔兰研究成功世界首例试管双犊，在“七五”和“八五”期间曾主持国家