新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定

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1、目录1删燃Y2337615中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日{』吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一“”“⋯“⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOe0⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯····⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·16附表⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37-综述骨骼肌肌源干细胞的特性及应用的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48中文摘要新生大鼠骨骼肌肌源性干细胞的分离、纯化、培养和鉴定摘要目的：肌源性干细胞(musclederived．stemcel

3、ls，ⅧSCs)移植治疗压力性尿失禁(SU)的研究深受关注，传统的治疗方法长期疗效不理想且并发症多，随干细胞研究的深入，干细胞移植成为肌肉组织损伤修复的一种重要手段，同时也为SUI的根本治疗带来希望。其中MDSCs倍受关注，它是肌肉中一种高度未分化的多潜能干细胞，具有体外分裂增殖快、自我更新、多向分化潜能和移植后存活率高等特点。并且取材资源丰富，操作方便，安全性高，是一种理想的种子细胞。由于肌肉组织中MDSCs数量少，所以MDSCs的分离和体外培养是进行移植的关键。本实验运用改良酶消化法和差速贴壁法分离纯化出MDSCs，通过细胞免疫组

4、织化学染色进行鉴定，并对其体外培养进行密切观察，掌握稳定的分离纯化和培养方法，为将来移植治疗SUI提供重要的实验依据。方法：1骨骼肌细胞的消化分离：实验动物为清洁级新生SD(Sprayue．Dawley)大鼠，雌雄不限。75％酒精浸泡窒息处死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎块(约lmm3)，PBS缓冲液吹打冲洗，静置后去除上清液，加入约2倍体积的混合酶(2．4u／mlDispaseII、O．5％I型胶原酶，2．5mmol／LCaCl2)，37℃水浴箱消化约l小时，加入生长培养基终止消化，过滤后离心弃上层液，重悬细胞后进行培养(37℃，5％C

5、02)。2MDSCs的分离、纯化和培养：培养2小时后贴壁细胞记为PPl，将上层液中未贴壁的细胞吸出后继续培养。24小时后，贴壁细胞记为PP2。每24小时进行差速贴壁培养，直到获得PP6。PP6培养3天后换液，每2～3天换液1次，待70～80％融合后传代培养。用0．25％胰蛋白酶消化细胞，加入胎牛血清终止消化，按1：2的比例进行传代培养。3MDSCs生长曲线的测定：取MDSCs传代培养的一代、四代和七代细胞，0．25％胰酶消化后，以3×104个／ml的密度接种于24孔培养板，每目随机选取3孔进行细胞计数，共记录8日，取平均值绘制细胞生长

6、曲线。中文摘要4MTT比色法观察不同接种密度对MDSCs生长的影响：取MDSCs传代细胞，调节细胞密度分别为2、4、6、8、10、12、15x105个／ml，接种于96孔培养板中，培养48小时后，每孔加入20ulMTT(5mg／m1)，37℃避光培养4小时后弃上清液，每孔加入100ul二甲基亚砜(DMSO)，振荡10分钟使结晶物完全溶解，在490nm处检测吸光度值。5MDSCs的鉴定：对获取的MDSCs(PP6)以及MDSCs传一代、四代、七代进行Desmin、Sca-1抗体免疫细胞化学染色，对PPI～PP6进行Desmin免疫细胞化

7、学染色，以成纤维细胞作为阴性对照，在显微镜下观察，以胞膜和／或胞浆内出现棕黄色颗粒判定为阳性，每组选取不同的视野进行计算阳性细胞占细胞总数的百分比。6统计学处理：使用SPSSl3．0统计软件处理实验数据，并进行统计学分析，P<0．05认为有统计学意义。结果：1MDSCs的消化、分离、纯化和细胞形态骨骼肌经过混合酶消化后得到肌纤维碎片、骨骼肌细胞、血细胞、成纤维细胞和内皮细胞等的混合物，用差速贴壁法将快速贴壁细胞与慢速贴壁细胞逐步分离，便可获得MDSCs。PPl、PP2以成纤维细胞为主，细胞数量多，贴壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；P

8、P3、PP4以肌细胞为主，数量减少，增殖较快，1周左右完全融合；PP6贴壁的细胞数量明显减少，多为小圆形或梭形，体积较小，折光性好，增殖缓慢，另有少量悬浮的细胞。培养72小时后细胞数量增多，呈现梭形或纺锤形，有小克隆团形