大鼠肌源性干细胞的分离、培养、鉴定及分离方法的比较

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1、硕士学位论文大鼠肌源性干细胞的分离、培养、鉴定题目及分离方法的比较Isolation,culture,identificationandcomparisonofseparationmethodofRatmuscle-derived英文题目stemcells姓名张贺庆学号200671027所在学院汕头大学医学院导师姓名刘久敏专业临床医学（七年制）入学日期2006.09答辩日期2013.05汕头大学医学院2006级硕士学位论文大鼠肌源性干细胞的分离、培养、鉴定及分离方法的比较Isolation,culture,identificatio

2、nandcomparisonofseparationmethodofRatmuscle-derivedstemcells课题来源自选学位申请人张贺庆指导教师刘久敏教授蒲小勇教授专业名称外科学泌尿外科基金资助国家自然科学基金（81270855,30801147）广东省医学科研基金（A2012016，A2008033）答辩委员会主席答辩委员会成员论文评阅人2013年4月21日星期五广州学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的

3、研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日大鼠肌源性干细胞的分离、

4、培养、鉴定及分离方法的比较硕士研究生：张贺庆指导老师：刘久敏教授，蒲小勇教授广东省人民医院（广东省医学科学院），泌尿外科，广东，广州510080中文摘要目的通过不同的方法分离肌源性干细胞、然后对其培养、鉴定，并比较肌源性干细胞表面抗原Sca-1的阳性率，寻找分离肌源性干细胞的理想方法，为下一步进行生长因子基因转染的肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁的动物实验奠定基础。方法根据消化酶添加的顺序及消化时间的不同，本实验采用常见的4种消化分离法从4-6周龄SD大鼠大腿分离肌源性干细胞，差速贴壁法纯化，通过流式细胞仪、细胞免疫荧光技术进行鉴定

5、，并比较不同方法获得的肌源性干细胞Sca-1的阳性率。此4种消化分离方法是：1、方法一：将适量骨骼肌组织碎块一次性放入Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DispaseII及胰酶的混合酶中消化；2、方法二：将适量骨骼肌组织碎块首先放入Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的混合酶中消化，再用DispaseII和胰酶的混合酶消化；3、方法三：将适量骨骼肌组织碎块放入Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的混合酶中消化，然后用DispaseII、胰酶分别消化；4、方法四：将适量骨骼肌组织碎块按先后顺序依次添加Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DispaseII及胰酶进行消化；I结果不同的方

6、法分离出的肌源性干细胞，流式细胞仪鉴定CD34、CD45及Sca-1抗体的阳性率分别为35.27%、5.24%及58.92%，细胞免疫荧光desmin抗体阳性；方法一、方法二、方法三及方法四分离培养的肌源性干细胞Sca-1平均阳性率不同,差别具有统计学意义（P=0.000<0.05），分别为46.5%±16.11%、50.95%±13.46%、55.38%±7.19%及71.58%±2.32%；方法一、方法二、方法三分离培养的肌源性干细胞Sca-1抗体的阳性率明显低于方法四分离培养的肌源性干细胞（P=0.000<0.05），差异具有

7、统计学意义。结论：不同的方法消化大鼠骨骼肌均可获得肌源性干细胞，但其纯度各异；消化酶之间的相互作用影响肌源性干细胞的纯度，单酶分步消化能提高肌源性干细胞纯度，方法四可作为本科研组肌源性干细胞的分离方法，分离高纯度的肌源性干细胞，用于下一步生长因子基因转染的肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁的动物实验研究。关键词肌源性干细胞；分离方法；培养；鉴定；比较IIIsolation,culture,identificationandcomparisonofseparationmethodofRatmuscle-derivedstemcellsH

8、e-QingZhang,Jiu-MinLiu,Xiao-YongPuPeople'shospitalofguangdongprovince(guangdongacademyofmedicalsciences),urology,guan