癌胚抗原单链抗体在细菌表面的展示及其应用初步研究.pdf

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1、分类号：Q789单位代码：10346密级：学号：2015111012040硕士学位论文中文论文题目:癌胚抗原单链抗体在细菌表面的展示及其应用初步研究英文论文题目:DisplayingCarcinoembryonicAntigenscFvontheSurfaceofE.colianditsPreliminaryApplication申请人姓名：蒋依俐指导教师：谢恬合作导师：阎辉专业名称：人体解剖与组织胚胎学研究方向：中药抗肿瘤药理所在学院：医学院论文提交日期2018.5杭州师范大学硕士学位论文杭州师范大学硕士学位论文致谢致谢三年的研究生生活就快要结束，在论文完成的最后

2、，想要留一块空白出来，对曾经给予我耐心指导和帮助的导师同学表示感谢，谢谢你们。首先，感谢我的导师谢恬教授和阎辉教授。本研究及学位论文是在我的导师谢恬教授和阎辉教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。老师们严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到项目的最终完成，谢老师和阎老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。三年来，不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向谢老师和阎老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。感谢罗砚曦老师和王淑玲老师对我的教育和培养。她细致认真地教会我每项实验技术，悉心地帮助我照顾

3、我，时刻关注我的工作学习并给予非常有益的建议。从她身上我不止学到了专业技术，也学到了一种踏踏实实工作实实在在做人的精神。感谢翟丽娟博士，感谢我的师兄王明龙和刘美丽师姐、曾义英师姐，感谢他们在实验工作中给我的无私帮助，陪我走过这段有苦有甜的研究生时光。感谢我研究生阶段每个给予我帮助的老师和同学。最后衷心地感谢我的父母和家人，感谢他们对我的养育之恩，感谢他们这么多年的默默付出，没有他们就没有我的全部。再次感谢所有给予我帮助的人！谢谢！I杭州师范大学硕士学位论文摘要中文摘要目的癌胚抗原(CarcinoembryonicAntigen，CEA)是广泛分布于胃肠道及其它组织起

4、源肿瘤细胞的肿瘤抗原，在恶性肿瘤诊断及肿瘤靶向治疗等方面具有重要应用价值，但经典的癌胚抗原检测ELISA方法涉及抗体制备和抗原或抗体蛋白包被等繁复步骤，有鉴于此，我们另辟蹊径，利用表面展示载体将癌胚抗原单链抗体(CarcinoembryonicAntigen-scFv，CEA-scFv)展示于细菌表面，有利于抗体与癌胚抗原的直接接触。方法1.构建pBAD-OmpA-mCherry-CEA重组质粒，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到重组菌。利用WesternBlot、胰酶消化实验以及全菌ELISA实验验证了重组菌的表面展示功能。2.为鉴定目的蛋白，首先

5、采用贴壁法和悬浮法检测肿瘤细胞表面癌胚抗原的表达水平，再利用ELISA法和免疫荧光显微镜观察重组菌与可溶性癌胚抗原的结合。3.利用细菌侵染实验验证重组菌对癌胚抗原阳性肿瘤细胞的特异性，再利用ELISA法和基于细菌的适配体连接免疫吸附测定(ALISA-B)检测重组菌与结肠癌患者血清癌胚抗原的结合能力。结果本实验成功构建了pBAD-OmpA-mCherry-CEA重组菌，胰酶消化实验结果说明重组菌表面展示的融合蛋白能够直接被胰酶所影响，其重组菌的表面展示功能得到了验证。全菌ELISA实验进一步证明了重组菌表面展示功能。重组菌与可溶性癌胚抗原的实验结果说明重组菌展示的目的

6、蛋白CEA-scFv能够有效结合可溶性癌胚抗原。细菌侵染细胞实验结果说明重组表达菌能够特异性靶向侵染癌胚抗原阳性的A549细胞。ELISA法和基于细菌的适配体连接免疫吸附测定实验中，均证明了在稀释度为10倍时实验组的OD450是对照组的2倍以上，初步证明表面展示CEA-scFv能够与结肠癌患者血清中的癌胚抗原结合。结论表面展示CEA-scFv的重组菌不但可以有效结合可溶癌胚抗原，还能与结肠癌患II杭州师范大学硕士学位论文摘要者血清中的癌胚抗原结合，此外，重组菌能够特异性靶向侵入癌胚抗原阳性的A549细胞。关键词：Lpp-OmpA；癌胚抗原单链抗体；细菌表面展示；II

7、I杭州师范大学硕士学位论文摘要ABSTRACTObjectiveCarcinoembryonicantigen(CEA)isatumorantigenwhichwidelydistributedingastrointestinalandothertissue-derivedtumorcells,anditisimportantforclinicaltumordiagnosisandtumortargetedtherapy.However,theclassicCEAELISAmethodinvolvespreparationofantibodyandantigen