草鱼三个c1q相关基因的克隆及表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M100107283上海海洋大学硕士学位论文题目：草鱼三个C1q相关基因的克隆及表达分析CloningandExpressionAnalysisofThreeC1q英文题目：GenesfromCtenopharyngodonidella专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：陈玥指导教师：李家乐教授二O一三年五月上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下

2、,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□,在年解密后

3、适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文草鱼三个C1q相关基因的克隆及表达分析摘要草鱼是中国乃至世界最重要的淡水养殖鱼类之一，具有悠久的养殖历史。但草鱼养殖病害频发，草鱼呼肠孤病毒所导致的草鱼病毒性出血病给养殖产业带来了巨大损失。迄今为止，有效预防这种传染病仍然十分困难，传统方法有其局限性。通过选育出抗病力强的草鱼新品种，再结合已有的预防和治疗方式来增强草鱼抵抗疾病传染的能力，不失为一条有效的路径。补体系统，作为先天性免疫中的一类重要和保守的体系，为机体提供了快速和高效地清除入侵微

4、生物的途径。C1q是补体经典途径的目标识别蛋白，除能够激活补体经典途径外，还具有参与机体免疫的多种功能。本研究克隆了草鱼三个C1q相关基因，C1qB、C1qC以及C1q-like，分析了它们的理化性质、氨基酸结构，比较了它们的同源性，研究它们在草鱼不同发育过程、不同组织及其受草鱼呼肠孤病毒感染后的表达情况，取得了如下结果：1．通过同源克隆方式得到草鱼C1qB和C1qC基因中间片段，从本实验室已构建的草鱼头肾均一化文库中获得C1q-like基因部分cDNA片段；进而采用RACE技术获得这3个基因的cDNA全长序列，分别为939bp，916bp，1202bp；

5、分别含有编码243（729bp），244（732bp），248（744bp）个氨基酸的开放阅读框，N端分别含有26，23，22个氨基酸信号肽序列。I上海海洋大学硕士学位论文2．BLAST分析发现，草鱼C1qB，C1qC和C1q-like都是较为保守的蛋白家族成员，草鱼与斑马鱼的C1qB、C1qC氨基酸序列相似度最高，分别达到67%、71%；草鱼C1q-like与斑马鱼C1qtnf5氨基酸序列相似度最高；选取各自基因不同物种的氨基酸序列，通过MEGA5.0软件，使用NJ方法构建系统进化树，发现草鱼与其它硬骨鱼类的亲缘关系最近，这些结果都支持了传统的进化理论，

6、反应了其实际的亲缘关系。3．多序列比对和蛋白功能结构域分析发现，C1qB、C1qC基因都包含有三个保守的结构域：N-端信号肽，胶原结构域和C-端球状结构域，且其氨基酸序列中与链间及链内的二硫键结合有关的四个半胱氨酸位点一致，并在不同物种中高度保守。但他们的氨基酸序列一致度并不高，表明他们的功能可能具有一定差异性。C1q-like基因具有与补体C1q高度同源的C-端球状结构域和与TNF-α相似的THD结构域两大C1q/TNF家族成员重要结构部分。4．利用实时荧光定量PCR技术检测健康草鱼各组织及使用草鱼呼肠孤病毒诱导后3个基因的表达谱，结果显示：3个基因在所

7、有被检测组织中均有表达，表明他们可能在草鱼体内发挥广泛的作用；3个基因均在脾脏、中肾、头肾等免疫器官内呈现高表达，也体现了其在免疫中起到重要作用。经诱导后，3个基因的大多数组织均出现了在显著上调的现象，尤其是免疫相关组织多在感染早期出现上调后呈下降趋势，此外，在皮、腮、肠等粘膜组织中也发现有参与免疫反应的迹象。分析健康草鱼和病毒注射后草鱼体内3个基因的表达情况，表明草鱼呼肠II上海海洋大学硕士学位论文孤病毒可以影响草鱼体内的C1q相关基因的表达情况，从而对机体产生一定的影响。5．为了解C1qB、C1qC和C1q-like基因对草鱼的胚胎发育所起到的作用，通

8、过实时荧光定量PCR技术对其进行检测显示：在卵子中均检测到3个基因