新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨

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1、硕士学位论文论文题目新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨研究生姓名孔红梅指导教师姓名熊思东教授专业名称免疫学研究方向感染与免疫论文提交日期2013年5月新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨中文摘要中文摘要目的：构建结核新型DNA疫苗pcDNA3.1-Rv3615c-Mtb10.4-Rv2660c(p846)，评价其在抗结核感染中的保护作用，并探讨发挥该保护作用的潜在机制。方法：通过分子生物学的方法构建含有结核杆菌三抗原融合表达质粒p846及单个抗原表达的重组质粒pcDNA3.1-Rv3615c(pRv3615c)，pc

2、DNA3.1-Mtb10.4(pMtb10.4)和pcDNA3.1-Rv2660c(pRv2660c)，测序鉴定正确后体外转染293T细胞，westernblot鉴定其在真核细胞内的表达。同时构建三个单抗原及融合抗原846的原核表达质粒，并应用GST标签和His标签Ni柱亲和层析技术进行相关蛋白纯化。将成功构建的三抗原融合基因疫苗和单抗原疫苗以肌肉注射的方式对小鼠进行免疫，具体免疫方式如下：选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分成6组，每组20只：p846组，pRv3615c组，pMtb10.4组，pRv2660c组，空载体p

3、cDNA3.1组及BCG阳性对照组，每只小鼠每次使用50μg的重组质粒于0、2、4、6周进行6免疫，其中BCG组在0周以5×10CFU的剂量皮下免疫一次。对免疫小鼠每隔两周进行一次血清中IgG抗体检测。末次免疫后两周，检测相应的细胞免疫应答类型：包括ELISPOT检测产生IFN-γ的T细胞数量、Brdu试剂盒检测T细胞增殖、LDH的释放检测T细胞的杀伤活性、流式细胞仪及ELISA检测相关的细胞因子等。末次免疫后4周，进行BCG攻毒，并于攻毒后的4-6周进行该疫苗的保护性实验检测（组织病理切片和CFU实验等），免疫后未攻毒的各组小鼠

4、再继续饲养用于相关的记忆性T细胞的检测。结果：1.构建了结核杆菌三抗原融合DNA疫苗p846，和单抗原DNA疫苗pRv3615c，pMtb10.4，pRv2660c及其原核表达质粒；2.细胞免疫应答检测结果如下：1）特异性T淋巴细胞增殖ELISA（Brdu）实验发现，构建的p846融合抗原疫苗可有效促进T细胞的特异性增殖，尤其在灭活的H37Rv和TFP846蛋白的刺激下，其OD值达2.5左右，显著高于单抗原疫苗组和空载体组（p<0.05）；2）IFN-γ的ELISPOT检测结果显示，与单抗原疫苗免疫组相比，三抗原融合基因疫苗p84

5、6可大量促进分泌IFN-γ的T细胞的产生；脾脏培养上清相关细胞因子的检测，发现p846疫苗免疫组显著增加了Th1型细胞因子如IFN-γ和TNF-α的分泌，同时I中文摘要新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨也促进了和Th1型应答密切相关的细胞因子IL-2和IL-17A的产生，与ELISPOT++结果相一致；3）通过胞内染色分析了p846疫苗诱生的体内特异性CD4和CD8T++++细胞的产生情况，发现p846疫苗免疫组脾脏CD4IFN-γ和CD8IFN-γT细胞比++++例分别为6.45%和7.61%；CD4IL-2和CD8IL

6、-2T细胞比例分别为24.1%，20.2%；++++CD4TNF-α和CD8TNF-αT细胞比例分别为59.3%，71.3%，相对单抗原疫苗组+(尤其是CD4T细胞)均有显著统计学差异（p<0.05）；3.体液免疫应答检测结果：通过小鼠血清中IgG抗体的检测发现p846疫苗可以诱生大量的高亲和力抗体的产生，OD值达3.25左右，滴度达1:4500，且主要以IgG2a亚型为主；4.组织病理切片HE染色的结果显示，攻毒后6周，p846疫苗免疫的小鼠：大部分肺泡结构清晰，肺泡腔内充血、出血明显减少，肺间质内仅有少量炎性细胞浸润；而单抗原

7、疫苗组及空载体组的小鼠：大部分肺泡结构破坏，肺泡腔内有大量充血、出血且有大量炎性细胞浸润；5.肺脏和脾脏CFU的结果显示，p846疫苗免疫组小鼠肺部结核菌载量即Log10CFU约为3.50，脾脏的Log10CFU约为2.70，相对于单抗原疫苗组（其中肺脏Log10CFU约为5.5，脾脏的Log10CFU约为5.0），有显著性差+异(p<0.05)；6.记忆性T细胞检测显示p846疫苗可显著促进效应型记忆性CD4T-+--（CD25CD44CD62LCCR7）细胞的产生，其值可达53.6%，相对于单抗原疫苗组pRv3615c的46.

8、1%，pMtb10.4的45.5%，pRv2660c的41.0%和空载组的37.3%，有显著统计学差异（p<0.05）。结论：我们构建的新型结核三抗原融合DNA疫苗p846免疫小鼠后，不仅能诱生强烈的细胞免疫应答和一定的体液免疫应答，还能有效的发挥