放射治疗联合dc疫苗抗肿瘤作用及其机制探讨

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1、河北医科大学硕士学位论文放射治疗联合DC疫苗抗肿瘤作用及其机制探讨姓名：常立甲申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：宋淑霞201203中文摘要放疗联合DC疫苗抗肿瘤作用及其机制探讨摘要目的：放疗是肿瘤治疗的重要有效手段之一。近年来，随着对放射生物学的深入研究发现，高能X射线作为放射治疗的重要方法，一方面利用其穿透力，使肿瘤细胞内部发生电离效应，破坏癌细胞的DNA结构，抑制或杀死肿瘤细胞；另一方面，射线通过诱导肿瘤细胞释放HMGB．1、HSP70等内源性“危险信号"而提高肿瘤细胞的免疫原性，同时会上调MHC—I和ICAM．1、VCA

2、M．1等粘附分子的表达，进而趋化免疫细胞，并激活宿主固有免疫应答甚至是适应性免疫应答。因此，放疗不仅仅是通过破坏肿瘤细胞生存所需要的信号分子影响细胞的生长，对机体抗肿瘤免疫也具有免疫调节作用。越来越多的基础和临床的研究表明，对肿瘤采取适当的联合治疗，可以取得更好的疗效。其中放疗联合免疫疗法的抗肿瘤作用越来越得到人们的认可。本研究主要是观察高能x射线与DC疫苗是否具有协同抗肿瘤作用，并对相关的免疫机制做初步研究和分析。方法：l观察X射线对4T1细胞凋亡诱导作用采用X射线照射，剂量为10Gy／次，间隔24／J,时连续照射三次，于末次照射

3、后24d,时，流式细胞仪检测细胞凋亡率。2HMGB．1和TGF．p蛋白表达水平的检测体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞至对数生长期，用X射线照射，剂量为10Gy／次，间隔24d'时连续照射三次，于末次照射后24小时，收集细胞，提取细胞总蛋白，Westernblot方法观察HMGB．1矛IJTGF一13蛋白表达。3DC疫苗制备、活性及其抗原呈递能力检测颈椎脱臼法处死BALB／cd、鼠，取小鼠股骨的骨髓细胞，利用细胞因子GM—CSF和IIL一4诱导树突状细胞分化，在培养的第5天，重新收集细胞计数，调节细胞数至1×106／ml，重新加入24孔细

4、胞培养板，加入X射线处理的4TlfJ中瘤细胞裂解液(终浓度5099／m1)，在37℃含饱和水气、5％的C02中文摘要培养箱中9呼育16d'时，然后再用LPS(100ng／m1)或TNF，Q(10ng／m1)刺激36h进一步诱导DC成熟。以PBS做阴性对照。流式细胞仪分析CDl1C+细胞的MHCII，ICAM．1，CD86的表达。用终浓度251ag／ml的丝裂霉素C处理的DC细胞做为刺激细胞，反应细胞是雌性C57BL／6小鼠的脾细胞。将反应细胞和刺激细胞分别以200：1、100：l、50：1的比例加入到96孔U型板中孵育96d,时，孵

5、育完成之前的4h每孔加入209lCellTiter96⑩AQueousOneSolutionReagent。用MTS比色法来检测反应细胞增殖情况。4分析X射线联合DC疫苗的抗肿瘤作用及其机制将4T1细胞经皮下接种给雌性、7．8周BABL／cd,鼠(6只／组)，X线照射方法为两种，间隔24h连续照射3次，每次10Gy，或300y照射1次。然后于瘤内注射DC疫苗(1×106／只)，接瘤后每天观察肿瘤生长情况；分析肿瘤浸润淋巴细胞TIL(tumor-infiltratinglymphocytes)中相关的CD8+T细胞矛NT-Reg细胞数

6、；检测荷瘤鼠脾脏中肿瘤抗原特异性淋巴细胞的CTL活性、T-Reg细胞数以及IFN-'y的分泌。利用Real．timePCR方法分别分析肿瘤细胞和TIL中的细胞因子IL。6、IL．10的表达以及趋化因子CXCL16／CXCR6的表达，并对肿瘤信号通路蛋白stat3和NF。1(B的表达进行Westem分析。结果：1采用X射线剂量为10Gy／次照射，间隔24h连续照射三次的方法处理体外培养的4T1细胞，可以诱导细胞凋亡，也可以引起细胞死亡。凋亡率14．88％。于末次照射后24小时，观察到HMGB．1的表达有增多趋势，而TGF．13表达有减

7、少趋势。2X射线处理的4T1细胞裂解液联合LPS明显促进DC的活化。与对照组相比，抗原刺激后经LPS诱导的表达CDllc表面标记的DC细胞中ICAM．1、MHCII及CD86的表达明显增多。4T1细胞裂解液负载联合LPS组的DC可以明显刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并随DC数目的增多而增强。3X射线联合DC疫苗显著抑制肿瘤细胞的生长，其中10Gy／次，间隔24h连续照射3次联合DC疫苗组，肿瘤生长最缓慢；且该组小鼠脾脏淋巴细胞IFN．1，的产生和CTL活性也最强。X射线联合DC疫苗可上调肿瘤组织CD8+T细胞数，虽然对T-Reg细

8、胞数的调节作用不明显，但可增中文摘要加CD8+T屏Reg的比例。4与对照组相比，10Gy／次，间隔24h连续照射3次联合DC疫苗组的肿瘤细胞中的IL．6、IL．10表达明显下调，CXCLl6表达有上调趋势；TILs中CXCR6的表达明