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《菠萝蛋白酶诱导k562细胞分化及其对p53基因表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、第38卷第1期厦门大学学报(自然科学版)Vol.38No.11999年1月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Jan.1999菠萝蛋白酶诱导K562细胞分化及其¹对P53基因表达的影响11221颜青陈瑞川郭大勇张铮杨善民12(厦门大学抗癌研究中心厦门大学生物学系厦门361005)摘要为进一步证实菠萝蛋白酶对肿瘤细胞的诱导分化作用,采用形态观察计数、血红蛋白定量测定、发光法测定细胞吞噬能力和Northern原位杂交法观察和检测了菠萝蛋白酶诱导K562细胞分化及其p53基因表达变化.结果显示,菠
2、萝蛋白酶可诱导K562细胞向红系和粒/巨噬系两个方向分化;在菠萝蛋白酶作用下,p53基因于给药后8h转录表达增强,24h达高峰,此后又下降,其时相变化先于分化发生.这些结果提示p53基因在Bromelain诱导K562细胞分化过程中可能起启动分化的重要作用,有关机制尚待深入研究.关键词诱导分化,菠萝蛋白酶,K562细胞中国图书分类号Q2.24肿瘤细胞诱导分化和分化治疗已被证明是一种较有前途的肿瘤治疗新手段,但有关菠萝[1]蛋白酶诱导肿瘤细胞分化的研究报道较少.菠萝蛋白酶(Bromelain,E.C.4.3.22.3)是从菠萝中分离纯化的
3、蛋白水解酶,属巯基蛋白酶类.我们在文献[2]中已报道了该酶对HL-60细胞的诱导分化作用.为进一步证实菠萝蛋白酶对肿瘤细胞诱导分化是否有普遍性,本文选择人红白血病K562细胞株为对象,研究了菠萝蛋白酶诱导K562细胞分化过程中细胞形态学、分化方向及p53基因转录表达变化等特征,以期初步探讨菠萝蛋白酶的抗肿瘤机理.1材料与方法1.1材料与试剂-5K562细胞株系本单位保存,以10细胞/mL接种于含10%小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中,37℃、5%CO2培养传代;菠萝蛋白酶纯化、激活及酶活力测定参照文献[3],以国际单位(
4、IU)表示酶活力;地高辛DNA标记检测试剂盒购自宝灵曼,硝酸纤维膜为Amersham产品,p53(cDNA)由本单位周红惠赠.1.2方法-21)给药处理:K562细胞按8mL/瓶接种于10mL的培养瓶中,第2天加入3×10IU/mL(终浓度)的菠萝蛋白酶,此后每天补加同量菠萝蛋白酶,对照组仅加相应量不含菠萝蛋白酶的稀释液.2)细胞计数及光镜观察:于血球计数板上常规苔酚蓝拒染法计数活及死亡细胞;细胞经¹本文1998-06-15收到;福建省自然科学基金资助项目·104·厦门大学学报(自然科学版)1999年常规Wright-Giemse染色后
5、,光镜下观察并计数200个细胞中分化细胞数计算分化指数,实验均重复2次,取平均值.[4]3)血红蛋白测定:参照临床生化检验测定血红蛋白方法,以联苯胺法测定分化细胞中6相对血红蛋白含量,以吸光值表示,每样品各取2×10个细胞,重复2次,取平均值.4)发光法测定分化细胞吞噬能力:按文献[5]以酵母多糖为吞噬颗粒,鲁米诺为冷光剂,液闪仪检测吞噬能力,用发光强度(CPM)表示.5)探针标记和Northern原位杂交分析:按试剂盒说明标记p53cDNA探针,并按鲍家[6]驹的方法进行Northern原位杂交分化.2结果2.1细胞计数及形态观察K5
6、62细胞经菠萝蛋白酶处理后,于不同时间分别取样对活细胞、坏死细胞及分化细胞计数,计算各自所占百分率,由图1可见随处理时间延长,分化细胞比率增高,菠萝蛋白酶对K562细胞具明显抑制作用,但坏死率始终较低.光镜下,分化细胞核/质比下降,胞质出现颗粒、空泡等分化标志,胞核呈肾形、分叶、杆状或无核(红系),核内有明显的块状或粒状异染色质凝聚并出现粒/巨噬系分化细胞(图2b)和红系分化细胞(图2c).图2菠萝蛋白酶对K562细胞形态的影响(处理3d,Wrigh-Giemsa染色,×1500)图1菠萝蛋白酶对K562细胞生长影响a.对照,b.粒/巨
7、噬系分化细胞,c.红系分化a.生长曲线;b.分化曲线;c.坏死曲线细胞(箭头示)Fig.1EffectofBromelainonK562cellFig.2EffectofBromelainonK562cellmorpholo-growthgy第1期颜青等:菠萝蛋白酶诱导K562细胞分化及其对P53基因表达的影响·105·2.2菠萝蛋白酶对K562细胞血红蛋白合成的影响-2-2-2以1×10IU/mL、3×10IU/mL和5×10IU/mL菠萝蛋白酶处理K562细胞3d,测定细胞内血红蛋白相对含量,结果见图3,可见菠萝蛋白酶具有促进K56
8、2细胞血红蛋白的合-2成作用,尤以1×10IU/mL最强.2.3菠萝蛋白酶对K562细胞吞噬能力的影响-2以3×10IU/mL菠萝蛋白酶处理K562细胞,分别于第3天和第4天取样测定细胞吞噬功能,结果见图4
