dna双链断裂末端的ku7080结合对同源重组修复通路的影响

《dna双链断裂末端的ku7080结合对同源重组修复通路的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、浙江大学博士学位论文DNA双链断裂末端的Ku70/80结合对同源重组修复通路的影响姓名：邵正萍申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：杨军；Prof.DavidJ.Chen20120527浙江大学博士学位论文中文摘要DNA双链断裂末端的Ku70／80结合对同源重组修复通路的影响浙江大学医学院病理学与病理生理学博士研究生邵正萍导师杨军教授中文摘要我们的遗传物质DNA不断受到诸如化学物质、电离辐射和紫外光等外源因素和代谢产物及活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)等内源性因素的损伤。DNA双链断裂(DNAdoublestrandsbreak，DSB)

2、是最严重的DNA损伤之一，耒修复或者错误修复的DSB会导致基因组重排、细胞凋亡、肿瘤发生和免疫缺陷。宾核细胞依靠DNA损伤反应(DNAdamageresponse，DDR)网络通过一系列的信号转导放大，最终走向DNA修复、细胞凋亡或染色体重构等结局来保护基因组的完整性。在DSB发生时，DDR通过细胞周期阻滞和两种DSB修复通路：同源重组(homologousrecombination,HR)和非同源末端连接(nonhomologousendjoining,NHEJ)来进行DNA修复。HR需要同源模板的存在来进行高保真的修复，而NHEJ则使用各种酶直接连接两个断裂的末端，因此保真度不如H

3、R，但NHEJ可以连接几乎任何类型的DSB末端。不同的细胞类型会偏重不同的修复通路，此外，还有两种因素参与DSB修复通路选择的调节：细胞周期的时期和DNA末端剪切。HR倾向于使用姐妹染色单体作为同源模板，因此被认为只在存在姐妹染色单体的S期和(32期活跃；NHEJ不局限于细胞周期的任何时期．但通常在GO期和G1期占优势。HR需要DNA末端剪切产生的3’端单链DNA突出来进行链侵入和配对，而NHEJ的发起因子Ku70／80虽然对于双链DNA(DoublestrandsDNA，dsDNA)具有很高的亲和性，IV浙江大学博士学位论文中文摘要但对于单链DNA(singlestrandDNA，s

4、sDNA)的亲和性减弱，因此末端剪切会推动DSB修复向HR方向进行。直接竞争学说认为，在细胞周期的S期和G2期，末端剪切发起因子MRN(X)(Mrell-Rad50-Nbsl／Xrs2)复合物和Ku70／80直接竞争DSB末端，而MRN首先占据DSB末端并迅速形成ssDNA来抑制Ku70／80与DSB末端的结合，从而使HR通路占据优势。直接竞争学说得到一些证据支持，但新的数据却发现Ku70／80对DNA的亲和性高于HR，因而该学说可能存在一定问题。因此，我们针对Ku70／80复合物与DSB末端结合是否有周期依赖性，以及这种结合对HR的影响展开了研究。我们的实验中显示，尽管NHEJ通路主

5、要在GO和G1期占优，在哺乳动物细胞的S期当HR作为主要的修复方式时，NHEJ的因子KuS0也可以聚集到DSB位点。并且其初始的聚集和在DSB位点的动力学特征与KuS0在非S期的哺乳动物细胞中相似。我们发现来自结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的Ku的同源物Mt．Ku可以在S期定位到365am脉冲氮气激光造成的DSB位点，并且可以较长时间滞留，因此我们使用其作为工具来测定哺乳动物细胞中，DSB末端被长时间的阻滞是否会影响DNA末端剪切和HR通路。DNA末端剪切产生的3’突出端会马上被RPA包被；而BrdU抗体只能识别整合在ssDNA中的BrdU，因此RPA和

6、BrdU焦点的形成就分别被作为ssDNA形成的间接和直接的测量手段。Rad51是介导链侵入和配对的不可或缺的HR因子，因此成为广泛接受的HR修复的标记物。我们在实验中观察到，在Ku缺失的啮齿动物细胞中补充Mt-Ku后，可见电离辐射(ironizingradiation，Ig)损伤后RPA，BrdU和Rad51焦点的形成明显下降，表明DNA末端剪切和HR介导的DSB修复的下降。HR实验中Mt．Ku转染细胞相对于未转染细胞HR完成百分比的减少也进一步证实了这一结论。Mt．Ku转染并不能改善Ku80缺失细胞的IR敏感性，表明Mt．Ku不仅无法介导NHEJ通路的进行，其长期占据DSB末端也造成

7、了HR修复能力的减弱。我们进一步探求了介导人类Ku70／80从DSB末端解聚的可能机制。实验室前期的KuS0动力学实验结果己表明人类细胞在磷脂酰肌醇3激酶样蛋白激酶(phosphatid，rlinositol3-l(inase-likeproteinkinase，PIKKs)家族抑制剂wortmannin的V浙江大学博士学位论文中文摘要作用下，激光损伤后120minKu80仍可滞留在DSB末端。本研究中的免疫染色实验数据也显示wortmanni