用同源重组的方法进行基因修复

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1、北京电子科技职业学院BeijingElectronicScienceandTechnologyVocationalCollege毕业论文设计题目用同源重组的方法进行基因修复系部生物技术系专业生物技术及应用班级12生物(1)姓名高亚平指导教师李晔2015年6月目录摘要iAbstractii第一章同源重组技术的研究进展11前言11.1微生物育种技术概述11.2同源重组技术发展21.3Red同源重组技术31.4CRISPR介导基因的编辑技术4第二章质粒ptarget的构建81材料81.1菌株和质粒81.2培养基与常用溶液81.4克隆中所用到的引物91.5仪器92方法92.1PCR反应体

2、系与反应条件102.2凝胶回收102.3gibson112.4将质粒Ptarget导入DH5α中112.5ptarget中N20的测序122.6ptarget质粒提取123结果分析123.1ptarget质粒的构建123.2N20测序对比134讨论14第三章基因组片段的获取与验证151材料151.1菌株和质粒151.2引物151.3大肠杆菌培养基161.4仪器162方法162.1细菌基因组的分离172.2PCR反应体系与反应条件182.3DNA片段的回收与纯化192.4T克隆的反应体系与反应条件192.5化学转化202.6T—clonevector的菌落验证PCR反应体系与反应条

3、件203结论与分析203.1mu-BL21基因组DNAtyrA、tnaB、talB、gabD、gabT基因的验证204讨论21第四章基因同源重组221材料221.1菌体和质粒221.2培养基与常用溶液221.2.2常用溶液与试剂231.3引物231.4仪器232方法242.1wt-BL21感受态的制备242.2cas9质粒的电转化242.3wt-BL21/cas9感受态的制备242.4各基因片段的同源重组252.5重组验证菌落PCR的反应体系与反应条件252.6同源重组成功的单克隆的获取262.7Ptarget和cas9质粒的去除283结果与分析284．讨论29第五章回补基因对菌

4、体生长和色氨酸生产的影响301材料301.1菌种和质粒302方法302.1RBS8质粒的扩增302.2mut-B8/mut-RBS8中mut-RBS8质粒的剔除312.3BL21、mut-B8、wt-B8、holo-B8感受态的制备312.4RBS8质粒的电转化312.5校正曲线制作312.6wt-BL8、holo-BL8和BL21生长曲线的对比312.7色氨酸含量的测定323结果分析324讨论35参考文献36致谢37摘要诱变育种是工业上获得性能优良的菌株的必要手段，但是在对表达载体进行生物诱变时，就会不可避免的造成工程菌本身染色体的变异，为研究这些染色体的变异对工程菌本身的影响

5、，本实验使用同源重组技术对通过artp诱导突变的BL8（BL21表达菌敲出3个基因后的工程菌）工程菌进行基因替换,并以色氨酸定位研究对象，观察其产率上变化，对其突变碱基对色氨酸的产量的影响进行了初步研究。同源重组是基因工程实验中常用的技术手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用，而red（一种能够应用于大肠杆菌的基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统）同源重组技术是利用red系统是一项可在染色体水平进行遗传操作的技术，只需要较短的同源序列而不需要特定的限制性酶切位点，即可完成。本课题以CRISPR为基本方法，采用同源重组技术利用cas9、ptarget两种质粒将突变型BL8菌的

6、tnaB、talB、tyrA、gabD、gabT、lplA、aroF这些基因组基因片段替换到野生型BL8菌中。得到重组后的BL21野生菌后，首先进行了重组菌与突变菌生长曲线的对比，而后又进行了色氨酸产量的定量分析。最终发现重组菌与突变菌B8以及BL21的生长曲线并没有比较明显的差异，而最后lplA，talB色氨酸产量高于野生型B8菌低于突变型B8菌，表明lplA与talB的突变碱基对色氨酸的合成有促进作用。关键词：同源重组，B8，CRISPRAbstractMutagenesisisapowerfulmethodtoobtainingstrainswithexcellentper

7、formance.However,mutagenesiswillhaveglobaleffect,andinevitablyleadtounwantedmutationsonthestrainchromosome.Thisstudyaimedtoinvestigatetherelationshipbetweenchromosomemutationsandstrainperformance.WeusedartptomutateB8strainsandfoundsomemutatio