用同源重组的方法进行基因修复的毕业论文.docx

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1、用同源重组的方法进行基因修复的毕业论文目录摘要iAbstractii第一章同源重组技术的研究进展11前言11.1微生物育种技术概述11.2同源重组技术发展21.3Red同源重组技术31.4CRISPR介导基因的编辑技术4第二章质粒ptarget的构建81材料81.1菌株和质粒81.2培养基与常用溶液81.4克隆中所用到的引物91.5仪器92方法92.1PCR反应体系与反应条件102.2凝胶回收102.3gibson112.4将质粒Ptarget导入DH5α中112.5ptarget中N20的测序122.6ptarget质粒提取123结果分析123.1ptarget质粒的构

2、建123.2N20测序对比134讨论14第三章基因组片段的获取与验证151材料151.1菌株和质粒151.2引物151.3大肠杆菌培养基161.4仪器162方法162.1细菌基因组的分离172.2PCR反应体系与反应条件182.3DNA片段的回收与纯化192.4T克隆的反应体系与反应条件192.5化学转化20II2.6T—clonevector的菌落验证PCR反应体系与反应条件203结论与分析203.1mu-BL21基因组DNAtyrA、tnaB、talB、gabD、gabT基因的验证204讨论21第四章基因同源重组221材料221.1菌体和质粒221.2培养基与常用溶液

3、221.2.2常用溶液与试剂231.3引物231.4仪器232方法242.1wt-BL21感受态的制备242.2cas9质粒的电转化242.3wt-BL21/cas9感受态的制备242.4各基因片段的同源重组252.5重组验证菌落PCR的反应体系与反应条件252.6同源重组成功的单克隆的获取262.7Ptarget和cas9质粒的去除283结果与分析284．讨论29第五章回补基因对菌体生长和色氨酸生产的影响301材料301.1菌种和质粒302方法302.1RBS8质粒的扩增302.2mut-B8/mut-RBS8中mut-RBS8质粒的剔除312.3BL21、mut-B8

4、、wt-B8、holo-B8感受态的制备312.4RBS8质粒的电转化312.5校正曲线制作312.6wt-BL8、holo-BL8和BL21生长曲线的对比312.7色氨酸含量的测定323结果分析324讨论35参考文献36致谢37II摘要诱变育种是工业上获得性能优良的菌株的必要手段，但是在对表达载体进行生物诱变时，就会不可避免的造成工程菌本身染色体的变异，为研究这些染色体的变异对工程菌本身的影响，本实验使用同源重组技术对通过artp诱导突变的BL8（BL21表达菌敲出3个基因后的工程菌）工程菌进行基因替换,并以色氨酸定位研究对象，观察其产率上变化，对其突变碱基对色氨酸的产

5、量的影响进行了初步研究。同源重组是基因工程实验中常用的技术手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用，而red（一种能够应用于大肠杆菌的基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统）同源重组技术是利用red系统是一项可在染色体水平进行遗传操作的技术，只需要较短的同源序列而不需要特定的限制性酶切位点，即可完成。本课题以CRISPR为基本方法，采用同源重组技术利用cas9、ptarget两种质粒将突变型BL8菌的tnaB、talB、tyrA、gabD、gabT、lplA、aroF这些基因组基因片段替换到野生型BL8菌中。得到重组后的BL21野生菌后，首先进行了重组菌与突变菌生长曲线

6、的对比，而后又进行了色氨酸产量的定量分析。最终发现重组菌与突变菌B8以及BL21的生长曲线并没有比较明显的差异，而最后lplA，talB色氨酸产量高于野生型B8菌低于突变型B8菌，表明lplA与talB的突变碱基对色氨酸的合成有促进作用。关键词：同源重组，B8，CRISPRiiAbstractMutagenesisisapowerfulmethodtoobtainingstrainswithexcellentperformance.However,mutagenesiswillhaveglobaleffect,andinevitablyleadtounwantedmuta

7、tionsonthestrainchromosome.Thisstudyaimedtoinvestigatetherelationshipbetweenchromosomemutationsandstrainperformance.WeusedartptomutateB8strainsandfoundsomemutationloci,thenartificiallyintroducedtheselociintowildtypeB8strainsviahomologousrecombination.Bycomparingthet