鸡白痢沙门菌s06004△spic突变株的构建及其免疫生物学特性初步研究

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1、刘男男：鸡白痢沙门菌S060044spiC突变株的构建及其免疫生物学特性初步研究!鸡白痢沙门菌S06004AspiC突变株的构建及其免疫生物学特性初步研究研究生：刘男男导师：焦新安教授中文摘要目前，鸡白痢沙门菌仍是我国养鸡业中危害严重的细菌之一，能造成巨大的经济损失。国内常采用药物控制该菌，但同时造成了细菌耐药性和药物残留等问题。此外，在实际生产中没有实施严格的检疫淘汰措施，使得鸡群中的鸡白痢阳性率仍较高。尽管许多国家逐渐使用活疫苗预防来控制沙门菌病，取得了很好的效果，但是由于鸡白痢沙门菌在发达国家基本消灭

2、且不感染人，有关它的疫苗研究报道较少，而已有的灭活疫苗的保护水平往往较低而不能产生坚实的免疫力。近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建新型减毒沙门菌作为疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，活疫苗可在免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全身免疫反应和局部免疫反应，并对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，也可作为疫苗载体运送外来抗原，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。本研究通过自杀性质粒介导同源

3、重组的方法构建了鸡白痢沙门菌毒力相关基因spiC缺失株，并评价了其生物学特性，初步探索了鸡白痢沙门菌S06004AspiC突变株作为减毒活疫苗的可行性。1鸡白痢沙门菌S060043spiC突变株的构建与鉴定为构建鸡白痢沙门菌S06004zlspiC突变株，以细菌S06004基因组为模板进行PCR扩增：spiC基因上游797bpDNA序列，spiC基因下游497bpDNA序列。将上游片段、Km抗性基因片段及下游片段成功连接后，克隆到pGMBl51自杀性质粒上，借助E．coli．Z7213感受态细胞，与野生株S

4、06004接合转移，进行同源重组，两步法筛选含Km抗性基因的3spiC突变株。对筛选得到的阳性克隆，再电转化导入编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20，去除Km抗性基因，结合PCR和测序结果，证明spiC基因缺失株S06004AspiC成功构建。进一步鉴定鸡白痢沙门菌S06004AspiC突变株的表型、生长特性、毒力等，结果表明该突变株生化鉴定与生长特性与野生株比较无显著差异，印妃基因缺失后，肌注接种3日龄海兰白雏鸡，其LD50约为1．12×109CFU，与S06004野生株LD50(约为7．27×10

5、6CFU)比，升高了约1．54×102倍，毒力显著降低。为后期研究其作为减毒鸡白痢沙门菌活疫苗的可能性奠定了重要基础。扬州大学硕士学位论文2减毒鸡白痢沙门菌S06004AspiC突变株的免疫生物学特性初步研究为研究鸡白痢沙门菌S06004AspiC减毒突变株的生物学特性，体外实验选取禽巨噬细胞系liD一11为模型，显示S06004AspiC突变株与野生株S06004相比，侵入巨噬细胞及在胞内增殖的增殖能力明显下降；将S06004AspiC突变株以口服和肌肉注射两种途径免疫3日龄雏鸡后，口服S06004Asp

6、iC突变株组在肝脏第7天被清除，在脾脏于第9．11天细菌被清除；肌注组在免疫后3-4周，细菌在体内被清除，其清除速度显著快于口服野生菌组。免疫保护效力实验显示，对3日龄雏鸡免疫后第10天，鸡白痢沙门菌野生株攻毒有良好的保护率，对相近血清型的鸡伤寒沙门菌的攻毒也有一定的保护作用。增重实验显示，利用突变株免疫后鸡的增重与空白组比无显著差异。利用间接ELISA检测血清中IgC；抗体，显示减毒鸡自痢沙门菌免疫后第l周可以检测到IgG抗体第3周抗体IgG达到高峰水平；免疫后第2周开始可以检测到黏膜抗体IgA，在第3—

7、4周达到较高水平。最后利用荧光定量PCR检测在感染过程中相关细胞因子mRNA的表达量变化，结果显示炎性因子IL．113表达水平随着宿主带菌量的升降而相应上调或下调，而细菌的清除与IFN．Y的表达同时进行，暗示减毒缺失株免疫后可激发相应的Thl型细胞介导的免疫反应。这为其作为沙门菌减毒活疫苗积累了重要资料。关键词：鸡白痢沙门菌S06004，印fc基因，同源重组，减毒活疫苗，免疫保护刘男男：鸡白痢沙门菌S06004AspiC突变株的构建及其免疫生物学特性初步研究三ConstructionofSalmonella

8、entericaserovarPullorumS06004AspiCanditsimmunobiologicalfeaturesM．S．candidate：NannanLiuAdvisor：Prof．Xin’anJiaoAbstractNowadays，thepullorumdisease(PD)causedbySalmonellaentericaserovarPullorumisanimportantdisea