体外诱导毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞定向分化的研究

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第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：：簋塑1日期：：丝：竺!第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：鍪!!指导教师签名：盘丝日期：知町．!，．竺 第三军医大学博士学位论文简写BPECDC／EBPCFEDABDEPCDMEMDMSOEBEDTAEGFPEMAFITCGFPICCIFIHCISHK19K10K．SFMPCRPBSPPAR'{RT．PCRSPTriSTRITC英文缩写一览表英文全称bovinepituitaryextractclusterofdifferentiationCCAATyenhancerbindingproteinCloning—formingefficiency313'-diarninobenzidinediethylpyrocarbonateDulbeccomodifiedEaglemediumdimethylsulphoxideetbylenebromideethylenediaminetetraaceticacidenhancergreentlourecentproteinepithelialmembraneantigenfluoreseeinisothiocyanategreenflourecentproteinimmunocytochemistryimmunofluorescenceimmunohistochemistryinsituhybridizationKeratin19Keratin10keratinocyteserunl．freemediumpolymerasechainreactionphosphatebufferedsolutionPeroxisomeproliferator-activatedreceptorTreversetranscri【ption-PCRstreptavidinperoxidasetris(hydroxymethyl)aminomethanetetramethylrhodamine中文全称牛垂体提取物同一分化抗原CCAAT／增强子结合蛋白克隆形成率3，3’．二氨基联苯胺焦碳酸二乙酯Dulbecco改良的Eagle培养基二甲亚砜溴化乙锭乙二胺四乙酸二钠增强型绿色荧光蛋白上皮膜抗原异硫氰酸荧光素绿色荧光蛋白免疫细胞化学免疫荧光免疫组织化学原位杂交角蛋白19角蛋白10角朊细胞无血清培养基多聚酶链式反应磷酸盐缓冲液过氧化物酶体增殖物激活受体Y反转录多聚酶链式反应链霉菌抗生物素．过氧化物酶三羟甲基氨基甲烷四甲基罗丹明 第三军医大学博士学位论文ExperimentalstudyoninduceddifferentiationofrathairfolliclebulgecellsintosebocytesinintroAbstractPreviousstudiesdiscoveredthatSlow—CyclingHighproliferatepotentialcellsofhairfolliclewerelocalizedtotheprominentbulgeregionwhichislocatedbelowtheopeningofthesebaceousductandservesastheattachmentsiteofarrectorpilimuscle．Recentlyexperimentdemonstratedthatbulge—locatedstemcellsCannotonlymigratetotheupperpartofthefollicletogeneratesebaceousglandsandepidermis，butalsogiverisetomanyofthecompartmentsofthelowerfollicle．Becauseoftheirintimaterelation，thehair，sebaceousandepidermisarecollectivelyknownastheepidermo·pilosebaceousunitorpilosebaceousunit．Asanappendixorganappendageofskin，sebaceousglandsplayanimportantroleofskinhomeostasis．SebumWasfoundtotransportantioxidantstOtheskinsurface．Inaddition，sebaceouswasfoundcouldprotecttheskinagainstoxidativestressand，especially，epidermalkeratinocytesagainstultravioletBirradiation，thesebum—specificlipidstoexhibitinnateantimicrobialactivity．Sebaceousglanddevelopmentandfunctionisregulatedbyanexpandingarrayofmoleculesincludingtranscriptionfactors，hormones，cytokinesandnuclearhormonereceptors．PPARVplaysaroleinstimulatingsebocytedevelopmentandlipogenesis，itregulatesthelatestagesofsebaceouscelldifferentiation，andisthemosteffectiveisotypeinstimulatinglipidproductioninthesecells．Althoughmuchexperimenthasbeenshowthathairfolliclestemcellswerethesourceofsebaceousglands，butuptOnow，therehavenotevidencecouldprovedthedifferentiationofhairfolliclebulgecellsintosebaceousglandcellsinvitro．Isolatingandcultivatingstemcells，whichbecameanobstacletoresearchonthecharacteristicofbulgecells．Inthisexperiment，first，weisolateandculturethehairfolliclestemcellsofratsandobserveitsgrowthpropertyinintro，andtheninduceddifferentiationofthebulgecellsintosebocytesinintro．Themainresultsarelistedfollowing：1．ImmunocytochemicalstainingwereusedtodetectexpressingofK19andK10inratshairfollicle，hairfolliclebulgeobtainedbymicromanipulationandenzymedigestionwereculturedintwodifferentconditions．serum．freeK—SFMandDMEM，F12thatadded2 第三军医大学博士学位论文10％fetalcalfserum，proliferationcapabilityandmorphologicchangewereanalyzedintwodifferentsystems．Theresultsindicatedthat：(1)Cells，whichexpressK19(specificmarkersforepidermalstemcells)WaSmainlylocatedinhairbulge，andbulgecellsnegativeexpressK10(differentiationmarkerofepidermalcells)．(2)Bulgecellsafterenzymedigestionpastedrapidly．Cellsweresmallandround，Pavingstone—shape，andhadalargenuclear：cytoplaSmratio．Thecharacteristicssuggestedaprimitivemorphologicfeature．Cellsgrowthwellandcouldmaintainlowdifferentiationandhigherreproductiveactivity．(3)lmmunocytochemicalstainingshowedthatK19arestronglyexpressedinculturedclusteringcells．Meanwhile，immunofluorescenceandImmunocytochemicalstainingshowedthecellsexpresseda6·integrinandK19strongly,weakornoCD71，butgraduallyweakenedanddecreasedtoaccompanythetimeselongate．(4)TheCFEandpositiveexpressionpercentageofK19weresignificantlyhirherinbulgecellscultivatedinserum—·freeK·-SFMthanthatofDMEM／F12added10％fetalcalfserlunrP<0．05)．2．Thebulgecellswereculturedinselectiveculturemedium，cellwereidentifiedbyimmunocytochemical，OilRed0stainingandwereobservedunderinvertedmicroscope．Theresultsshowthat：(1)Cellsweresmallandround，andhadalargenuclear：cytoplaSmratioinprimaryculture，thenemergeddifferentiationgradually,cellsbecamebigger,themorphologyofcellsweresimilartosebocytes，lipiddropletscouldbeseenincytoplasm．Thisphenomenonnotoccurrencecontrolgroups．(2)TheredlipiddropletsaroundcellnucleusstainedbyOilRedOinbulgecellsinducedafter3weeks，andcellspositiveexpressedEMAandPPARy．3．RecombinantplasmidpEGFP·PPAR72wereconstructedsuccessfullywithsequencingidentification，andtransfeetedbulgecells．Theresultsshowthat：(1)Transfectedcellsstablyexpressedgreenfluorescence．(2)ImmunocytochemicalstainingshowedthatPPARl,wereexpressedinthetransfectedcells．4．Thedifferentiationofbulgecellsintosebocyteswerestudiedinbulge-PPAR72，bulge·mockandbulgecellsbyimmunocytoehemical，RT-PCR，OilRedOstaining．Theresultsindicatedthat：3 第三军医大学博士学位论文(1)ImmunocytochemicalstainingshowedthatPPAR7wereexpressedintheratshairfollicleinternalrootsheath，sebaceousglandsandsuperiorpartofbulgeneatsebaceousgland，butnotinoutrootsheath．(2)After3weekspostdifferentiationlipiddropletscouldbeseeninbulge—PPAR72cytoplasm，cellsstainedpositivelyforthesebaceousglandantigenEMA，numerouscytoplasmiclipiddropletsweredetectedbyOilRedOstainingandcellspositiveexpressedPPARl,，butthosephenomenonnotoccurrencecontrolgroups．(3)ThepositiveexpressionratioofEMAandOilRedOstainingwerehigherinbulge‘PPAR72thanbulge·mock．(4)TheorderofdensityofPPARr2，C／EBPuexpressionis：bulge-PPARV2>inducedbulgecells>non—inducedbulgecells，theexpressionofC／EBPl3havenosignificantdeviationinthosethreegroupcells．Inthisstudy,wesuccessfulculturethehairfolliclebulgecellsandobserveitsgrowthpropertyinintro，andfirstfoundhairfolliclebulgecellshavethecapabilitytodifferentiationintosebaceousglandcellsinvitro，PPAR72playanimportantroleindifferentiation．WealsofoundGFPgeneCanbetransfectedintothebulgecellsandCanbeexpressedeffectivelyinthebulgecells．Keywords：hairfolliclebulgesebaceousglandsebocytedifferentiationGFPPPARC／EBP4 第三军医大学博士学位论文体外诱导毛囊Bulge细胞向皮脂腺细胞定向分化的研究摘要毛囊是皮肤重要的附属器官，具有周期性生长的特点。目前已知毛囊干细胞位于外根鞘的隆突(bulge)区，研究证明毛囊bulge细胞具有多向分化的能力，不仅能分化形成毛囊，还能够形成皮脂腺和表皮角朊细胞。由于表皮、毛囊和皮脂腺关系密切，一般将三者统归为表皮．毛囊．皮脂腺单位(epidermo—piosebaceousunit)或表皮和毛囊皮脂腺单位(piosebaceousunit)。皮脂腺(sebaceousgland)是皮肤重要的附属结构，具有抗炎、抵抗外来微生物的作用；它能够抗氧化，特别是抗紫外线的侵袭，对保持皮肤的完整和功能正常存着重要的作用。皮脂腺细胞的发育分化过程十分复杂，包括细胞形态的改变和基因表达的变化。过氧化物酶体增殖物激活受体7(peroxisomeproliferator-activatedreceptor，PPAR7)在成脂细胞分化过程中起着关键的作用，它能有效促进脂质合成。在PPAR7的三种亚型中，PPAR72与脂肪和皮脂腺细胞的分化尤其相关。PPAR72是脂肪细胞分化过程中重要的调节因子，它可促使成纤维细胞或骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。尽管多项证据表明皮脂腺的更新和维持来源于毛囊的Bulge细胞，但是，至今仍未在体外实验中观察至Obulge细胞分化为皮脂腺细胞的直接证据。毛囊干细胞体外分离培养技术的相对滞后，影响了研究的进一步深入。我们在体外分离培养了毛囊bulge细胞，并在一定的条件下诱导bulge细胞向皮脂腺细胞定向分化，同时构建PPAR72质粒，通过脂质体将其转染至lJbulge细胞中，观察它对bulge细胞定向分化为皮脂腺过程中的作用。主要结果如下：1、毛囊buIgerm胞的分离培养及生物学特性的研究采用免疫组化及原位杂交技术，检测大鼠毛囊Bulge区细胞干细胞表面标志物和分化标志物的表达情况，运用显微分离及酶消化法分离并培养大鼠毛囊Bulge细胞，观察培养的毛囊bulge细胞体外生长特性，同时比较了不同培养体系对bulge细胞生物学特性的影响。结果发现：(1)干细胞表面标志物K19的表达主要位于毛囊的Bulge区，而该区不表达毛囊上皮的细胞分化标志K10。(2)经酶消化后的毛囊Bulge区组织易贴壁，24h后即有细胞爬出，沿Bulge区向外扩展生长，3-4天后细胞出现融合， 第三军医大学博士学位论文细胞在培养6～7天细胞数量达峰值，以后细胞生长减慢，传代后细胞成克隆生长，生长良好，细胞形态均一，呈铺路石状，核浆比例大，表现出原始细胞形态的特征。(3)免疫细胞化学检测，群集生长的毛囊Bulge细胞表达K19，运用免疫荧光双标方法检测细胞Q6整联蛋白和CD71的表达，该干细胞强表达Q6整联蛋白，而CD71表达较弱。传代后及随着培养时间的延长，细胞的K19阳性表达逐渐减弱，阳性细胞逐渐减少。f4)观察第一代无血清KSFM培养基中的bulge细胞的生长曲线与含血清的DMEM培养基无明显差异，但是比较不同代次间bulge细胞克隆形成率和K19阳性率，无血清KSFM组明显优于含血清的DMEM组。因此，对比传统的培养体系，本实验采用低钙无血清培养体系对保持bulge细胞的生物学特性更为有效。2、体外诱导毛囊buIge细胞向皮脂腺定向分化的初步研究本部分我们观察了大鼠毛囊bulge细胞在体外诱导环境下向皮脂腺细胞定向分化的能力，体外分离培养大鼠毛囊bulge细胞，然后在诱导培养基中培养，观察细胞的分化情况。结果发现：(1)光镜下可以观察到，bulge细胞开始培养时体积小、核大，核仁明显，细胞器少，呈现典型的原始细胞形态。随后细胞逐渐出现分化，胞体增大，细胞略呈圆形，胞浆丰富，胞浆与核的比例增大。进一步培养，可见一些细胞的核周围内有少量脂滴合成。诱导培养3周左右，核周的脂滴逐渐增多，形态类皮脂腺细胞结构。同期培养的毛囊bulge细胞未出现此现象。(2)光镜下观察，诱导三周后毛囊bulge油红0染色阳性，可以见到脂滴为鲜红色，排列于胞核周围，免疫细胞化学检测诱导后细胞表达EMA。(3)免疫细胞化学检测结果显示，经过诱导培养的毛囊bulge细胞表达PPARy蛋白，阳性信号为棕黄色，主要位于胞浆，同期培养的毛囊bulge细胞表达弱阳性。3、PPAR?2载体的构建及GFP标记在毛囊buIge细胞中表达用基因克隆方法，成功构建了pEGFP—PPAR72真核表达载体，然后转染毛囊bulge细胞。结果发现：(1)倒置显微镜下观察，转染后的细胞稳定表达绿色荧光，为下一步实验奠定了基础。(2)免疫组化结果发现，转染后的细胞表达PPA聊蛋白，阳性信号为棕黄色，主要位于胞浆。4、PPARy2促毛囊buIge细胞向皮脂腺细胞定向分化本部分采用免疫组化、质粒转染、RT-PCR及油红0染色等方法观察了PPART2对毛囊bulge细胞向皮脂腺分化的影响。结果如下：(1)免疫组化结果显示，PPAR7在成人全毛囊中均有表达，其中毛囊内根鞘、皮脂腺阳性最强，bulge区也有表达，但是信号较弱。在大鼠中主要表达于毛囊内根鞘和皮脂腺，在bulge上部靠近皮脂腺区也6 第三军医大学博士学位论文有表达。免疫细胞化学检测发现，体外培养的毛囊bulge细胞弱表达PPA脚。(2)光镜下可以观察到，bulge—PPAR叮2细胞诱导培养3周左右，核周的脂滴逐渐增多，形态类皮脂腺细胞结构，油红。染色示脂滴为鲜红色，集中于胞核周细胞表达皮脂腺的标志EMA，阳性信号为棕色，主要位于胞浆。bulge—mock细胞形态和实验组类似但未见脂滴的合成。(3)bulge—PPARy2的油红O染色阳性率明显高于未转染质粒组细胞，虽然EMA阳性率差别不如油红O阳性率明显，但可以看到转染PPARy2质粒组细胞的阳性强度高于未转染质粒组细胞。(4)我们检测了PPA聊2、C／EBPa、D在PPA脚2质粒转染组、诱导培养后bulge细胞、同期培养的bulge细胞中表达的差异，结果发现，PPAR72和C／EBPct在三组细胞的表达强弱依次为：PPAR72质粒转染组>诱导后bulge细胞>同期培养的bulge细胞，而C／EBPl3的表达差异不大。免疫细胞化学的结果与此相同。关键词：毛囊bulge细胞皮脂腺皮脂腺细胞分化绿色荧光蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体CCAAT／增强子结合蛋白 第三军医大学博士学位论文体外诱导毛囊Bulge细胞向皮脂腺细胞分化的实验研究刖舌皮脂腺(sebaceousgland)是皮肤重要的附属结构，对保持皮肤的完整和功能正常有着重要的作用【lJ。在人体的不同部位皮脂腺分布密度不同，以头皮、面部，特别是眉间、鼻翼和前额部晟多，其次为躯干部中央部位及腋窝。皮脂腺大多紧邻毛囊的隆突(bulge)区上部，为泡状腺，由一个或几个囊状的腺泡与一个共同的短导管构成。导管为复层扁平上皮，升口于毛囊外根鞘或表皮。腺泡周边是一层较小的幼稚细胞，呈立方形，核圆．细胞增殖力强，生成新的腺细胞。新生的腺细胞渐变大，并向腺泡中心移动，胞质中形成越来越多的小脂滴。最后，腺细胞解体，连同脂滴一起排出，即为皮脂。皮脂腺是一种全浆分泌腺，没有腺腔，整个细胞破裂即成分泌物口j。以往认为，皮腊腺的作用仅限于分泌皮脂，但新近的研究发现皮脂腺细胞具有抗炎、抵抗外来微生物的作用；它能够保护皮肤，具有抗氧化，特别是抗紫外线的作用。附图1皮脂腺结构图皮脂腺细胞的发育分化过程十分复杂，包括细胞形态的改变和基因表达的变化。脂质的合成与分泌是皮脂腺细胞分化成熟的标志‘”，有许多因子能够在转录水平调节 第三军医大学博士学位论文皮脂腺细胞的脂质合成，由于这些分子在脂质代谢中有明显的作用，因而可能有助于bulge细胞向皮脂腺分化。PPAR是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员(4)，可分为a、B(或6)和?--种类型，其dPPPARy主要表达于脂肪组织及免疫系统，在脂肪细胞分化过程中起着关键的作用。Rosenfield等(5)发现PPARy激活剂和DHT能促使皮脂腺细胞分化，两者作用叠加，但是单纯使用雄激素诱导皮脂腺分化效果不佳，添加PPARy激动剂后，皮脂腺细胞出现明显分化。PPAR?反应元件常位于脂质代谢相关蛋白或酶基因的上游，当PPAR?与其反应元件结合时可激活这些基因的表达，从多环节参与脂质代谢。一些细胞因子如TNF-a，IFN吖，IL-2，和TGF—p能够抑制脂质的合成，但活化的PPARy能降低这些细胞因子的表达，从而促进脂质合成【6．7J。在PPAR了的三种亚型中，PPARy2与脂肪和皮脂腺细胞的分化尤其相关。PPAR?2是脂肪细胞分化过程中重要的调节因子，它可促使成纤维细胞或骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化(8)。长期以来，关于皮脂腺的细胞来源说法不一，以往认为皮脂腺基底部细胞分化程度低，增殖能力强，是皮脂腺细胞的干细胞来源【9)。Inaba(10)等研究发现皮脂腺的基底细胞很容易结合3H，猜测皮脂腺可能具有自身的干细胞。但是在皮脂腺中并没有检测到慢周期细胞，而且皮脂腺细胞体外增殖能力比毛囊上段低得多。有实验发现，皮脂腺被破坏后可以从毛囊外根鞘的隆突区(bulge)重新生成。因而皮脂腺的更新来源于毛囊bulge细胞，是目前比较公认的观点。毛囊具有周期性生长的特性，能通过自身的干细胞进行自我更新，毛囊干细胞的研究也是毛囊细胞生物学研究的基础。以往研究曾认为，毛囊上皮干细胞位于毛母质，现在多数研究认为干细胞位于毛囊的隆突部和外根鞘的最外层。毛囊的隆突部的细胞有些方面符合干细胞的特征：具有缓慢的细胞增殖周期，在损伤或某些生长刺激后增殖；超微结构和生化特征方面显示相对的未分化；存在的部位血管丰富，营养条件好：具有自我更新能力和增殖潜能，在培养状态下毛囊隆突部位的细胞克隆形成能力强。1990年，孙同天(1”等将标记的3H．TdR注射到新生小鼠的皮下，然后进行放射自显影研究，发现标记保留细胞位于毛囊外根鞘的bulgel叉，通过创伤诱导，bulge区的标记保留细胞明显增加，通过电镜观察，bulge细胞呈现典型的未分化状态。由此作者提出了毛囊隆突激活假说，认为毛囊干细胞定位于毛囊的Bulge，它具有多向分化潜能，它能够向下分化形成毛囊，也可以穿过毛囊狭部，转化成为毛囊间表皮和皮脂腺的祖细胞。从组织胚胎发育的角度来看，毛囊的原基此后这一观点不断得到证实。Tayor(”’等采用3H与BrdU双标技术进一步确认了干细胞定位于毛囊的Bulge部位。Oshima03)等人通过转基因毛囊微嵌和体实验发现毛囊Bulge细胞不仅可以形成毛囊分化的所有细 第三军医大学博士学位论文胞系，也可以分化成皮脂腺和表皮。由于表皮、毛囊和皮脂腺关系密切，一般将三者统归为表皮．毛囊皮脂腺单位(epidermo-piosebaceousunit)或表皮和毛囊皮脂腺单位(piosebaceousunit)。尽管多项证据表明皮脂腺的更新和维持来源于毛囊的Bulge细胞，但是，至今仍未在体外实验中观察至lJbulge细胞分化为皮脂腺细胞的直接证据。毛囊干细胞体外分离培养技术的相对滞后，影响了研究的进一步深入。我们在体外分离培养了毛囊bulge细胞，并在一定的条件下诱导bulge细胞向皮脂腺细胞定向分化，同时构建PPARr2质粒，通过脂质体将其转染到bulge细胞中，观察它对bulge细胞定向分化为皮脂腺过程中的作用。10 第三军医大学博士学位论文第一部分毛囊bulge细胞的分离培养及生物学特性的研究毛囊是皮肤的重要附属器官，具有增殖活跃、周期性明显等特点，主要由上皮部分(包括外根鞘、内根鞘)和真皮部分(即毛乳头及真皮鞘即结缔组织鞘)组成的，其中外根鞘与表皮连续。Montagna和Chase(14)1956年研究发现，用X射线将毛生发中心破坏，但外根鞘细胞能再生一个完整的毛球部，因此Montagna提出，毛囊每一代的种子或生长源肯定在外根鞘。Cotsarelis(Is)等1990年对小鼠皮肤进行3H．TdR掺入试验，发现毛囊隆突部是LRCs的唯一栖息地，从而提出了毛囊干细胞定位于毛囊隆突部的假说。目前的研究认为毛囊外根鞘的隆突xlX(Bulge)存在毛囊干细胞，毛囊干细胞不仅对维持毛囊周期性生长具有重要作用，而且还能进一步分化为表皮和皮脂腺。近年来，国内外学者(16’"’运用细胞培养技术，将毛囊Bulge分离出来，并成功培养了毛囊干细胞。但是如何在体外培养中大量扩增毛囊干细胞，而尽量减少其分化，仍是一个有待解决的问题。本部分分离培养了毛囊bulge细胞，并观察其体外生长的生物学特性。比较了毛囊Bulge细胞在不同培养条件下的生物学特性，旨在寻找更为理想的培养方法，从而为进一步深入研究毛囊发育分化提供了实验基础。一、材料(一)主要实验设备PCR扩增仪水平电泳仪凝胶电泳图象扫描仪紫外检测仪超净工作台C02培养箱倒置相差显微镜普通光学显微镜荧光显微镜材料与方法MJresearch北京Bio—RadBio．Rad苏州HeraeusLeicaNikon 第三军医大学博士学位论文体式显微镜低温高速离心机台式离心机电子天平一20℃低温冰箱一80℃低温冰箱冰冻切片机纯水系统(二)主要药品与试剂TripureDEPCK19扩增引物RT-PCR试剂盒胶回收试剂盒SP一9000羊抗鼠免疫组化试剂盒S-P免疫组化试剂盒抗体稀释液小鼠抗人K19单抗小鼠抗人K10单抗兔抗Q6-ingtegrin多克隆抗体TRITC标记山羊抗兔IgGFITC标记山羊抗兔IgGDABPBS粉末MarkerDMEM／F12(1：1)干粉培养基K—SFM无血清培养基牛脑垂体提取物胰岛素胎牛血清胰蛋白酶Roche上海生工TakaRaOmega北京中山福建迈新公司北京中山SantaCruz北京中山天为时代HycloneSigmaGibco公司SigmaHycloneBiosource～～埔蝻一一～～ 第三军医大学博士学位论文Dispase青霉素、链霉素EGFEDTADMSo多聚赖氨酸L一谷氨酰胺蔗糖Sigma重庆Sigma广东Sigma重庆(三)主要试剂配制1．5xTAE500ml电泳缓冲液的配制：称取12．19Tris碱，2．855ml冰乙酸，0．5MPH8EDTA5ml，定容至500ml。2．0．01MPBS溶液的配制：将袋装的PBS干粉完全溶于1000ml纯水中，即得0．01MPBS溶液。3．DEPC水：将DEPClml加入1000ml蒸馏水中，混匀，静置过夜备用。4．抗原修复液的配制：取21．019柠檬酸溶于1000ml纯水中得A液；取29．419柠檬酸三钠溶于1000ml纯水中得B液；取A液9ml，B液40ml，溶于450ml纯水中，定容至500ml，即得抗原修复液。5．4％多聚甲醛的配制：称取多聚甲醛409，置于烧瓶中，加入500ml0．1MPBS，加热至60℃，磁力搅拌使粉末充分溶解，逐滴加入1NNaOH，调定PH至7．4，最后用0．1MPBS定容至l升，过滤后备用。6．青霉素合链霉素双抗溶液的配制：80万单位瓶装青霉素粉末加入8ml灭菌双蒸水，即得10万单位／ml溶液；100万单位瓶装硫酸链霉素粉末加入10ml灭菌双蒸水，亦得10万单位／ml溶液；各取0．1ml稀释的溶液混合后分装冻存，备用。7．无血清K．SFM培养基：每100mlK-SFM中添加BPE5mg，rEGF1¨g，L一谷氨酰胺30mg，青、链霉素各100U。8．含双抗的D．Hank’S液：每100mlD．Hank‘S中添加青、链霉素各100U。9．DMEM／F12培养基：每90mlDMEM／F12中添加rEGF1¨g，L·谷氨酰胺30rag，优质胎牛血清10ml，青、链霉素各100U。10．0．25％Dispase溶液的配制：准确称取0．259Dispase酶粉末，加入100m10．01MPBS溶液，完全溶解后抽滤分装，4"C或一20℃保存。二、方法 第三军医大学博士学位论文(一)免疫组织化学检测1．载玻片处理：重铬酸甲液浸泡24h，自来水漂洗干净后，蒸馏水冲洗3次，烘干，将玻片浸泡于稀释的多聚赖氨酸溶液5min，晾干备用。2．取整形手术后成人头皮及七日龄大鼠触须皮肤，4％多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5pm切片备用，免疫组化检测K19及KIO的表达，具体步骤如下：f11石蜡切片二甲苯脱蜡3x5min：(2)依次在无水、95％、85％、75％、50％酒精中水化各5min，蒸馏水冲洗5min，PBS浸泡x5min：(3)滴加3％H202，室温下封闭15rain，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS漂洗3x3min；(4)加入柠檬酸抗原修复液，加热到92。C进行抗原修复10min，室温下冷却20min，PBS漂洗3x3min；(5)滴加二抗的正常血清封闭，室温孵育15min；(6)弃去封闭血清，勿洗，加一抗(以PBS代替一抗作为阴性对照)，4"C过夜；PBS洗3x3min；(7)加生物素化通用型二抗，37。C孵育30min，PBS洗3x3mim(8)加三抗(SP)，37。C孵育30min，PBS洗3x3min；(9)滴加DAB显色，苏木精复染，镜下观察显色结果；(10)自来水充分冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。(11)所有阳性信号定位于胞浆，呈棕黄色，无明显的背景染色。(二)原位杂交检测1．标本来源：整形手术后成人头皮，取自西南医院。2．实验中所用玻片、EP管先经重铬酸甲液浸泡24h，自来水漂洗干净后，蒸馏水冲洗3次，烘干，在DEPC水中浸泡过夜，高压消毒，烘干备用。器械均经过消毒，去RNA酶处理。3．RT-PCR提取K19片段3．1总RNA的提取(1)无菌条件下取组织，D．Hank’S清洗，置于匀浆器中小心剪碎；(2)加适量tripure(10mg组织加O．8mltxipure)，在冰浴中将组织研细；(3)将匀浆加入到EP管中，室温下孵育5min； 第三军医大学博士学位论文(4)加入O．2ml氯仿，震动混匀lmin，室温下孵育15min；(5)120009，4"C，离心15min；(6)取上清于另一EP管中，对等体积加入异丙醇，颠倒混匀30sec，室温下孵育5min；(7)120009，4"C，离心10min，弃上清；(8)加入lml75％酒精洗涤沉淀3min；(9)75009，4"C，离心10min，弃上清；(10)自然烘干，加入20plDEPC水溶解，一80。C保存。3．2总RNA样品纯度及含量测定应用紫外分光光度计测定样品总RNA在波长260nm及280nm处吸光度的比值来确定其纯度和浓度。确保比值在OD260／OD280=1．7-2．0之间，按|OD260=40肛g／ml单链RNA计算其含量，电泳可见清晰的28s、18s条带，说明总RNA提取完整，无降解。4．半定量RT-PCR4．1cDNA的合成参照TakaRa说明书操作，反应体系为：5xbuffer5．0．1lRNA酶抑制剂1．0．al随机引物1．0．1ll0mMdNTPs2．0．1lAMVRTaseXL1．0．1l模板总RNA1．0．1l无RNA酶去离子水9-0．1l以上操作在冰上进行，总体积为20111，25"(2孵育10min，37。C孵育60min，最后70min反应10min，冰上冷却。4．2引物合成K19引物通过primer5．0软件设计，由上海生工合成，其序列为：SCNCC5’CTCCGTCCGTGCTCCGCCTCG3’：antisence5’GCAGCCAGACGGGCGTTGTCG3’，产物长度为508bp。4．3PCR扩增目的片段：25mMMgCl24．0111lOxbuffer5．0111I5 第三军医大学博士学位论文2．5mMdNTPs8．0al25Mm上游引物0．51125Mm下游引物玑511CDNA2．0．11TakaRaExTaqDNA聚合酶n5．11ddH2029．511反应总体积为50111，95℃变性5min，然后95℃变性45see，60"C退火45sec，729C延伸45see，30次循环后，72"C延伸5min，4"C保温，电泳鉴定目的片段。4．4胶回收K19目的片段(1)先取一空的1．5ml离心管，称重为W1；(2)将电泳的所需条带处的凝胶块切下(尽量在30秒内切下)，移至已称重的离心管内。(3)称此重量为W2g，则凝胶块重量为(w2一W1)g．折算成体积为(w2一W1)m1．(4)加入3--4倍凝胶块体积的Bindingbuffer(不超过800}t1)。(5)在55—65。C水浴孵育7分钟或至凝胶块完全溶解，每2～3分钟振摇一次。(6)将此溶液750ul加入到套有2ml收集管的HiBindextractioncolumn(抽提柱)中。(7)室温100009离心1分钟，弃滤液。(8)加入3009lBindingbuffer，100009离心1分钟。(9)用750脚冲洗液(washbuffer，用无水乙醇稀释)冲洗柱子，等待2．3分钟后，室温100009离心1分钟。(10)重复步骤9一次。(11)弃液体，100009离心空柱1分钟。(12)将柱子放置在1．5ml干净的离心管上，用30～509lDNA洗脱液(DNAElutionbuffer)冲洗DNA，100009离心1分钟。4．5探针标记按罗氏产品手册进行：37℃水浴20小时后，65℃10分钟终止反应；加入3．1肛lLicl(4M)及959l无水乙醇，混合均匀；在一70℃冰箱放置3小时；120009离心15分钟：去上清，用5011170％冷乙醇清洗；120009离心10分钟，弃上清；16 第三军医大学博士学位论文60。C烘箱烘干；用509lDEPC水溶解，．20"C放置。4．6标记过程(1)在2—9管中取11．tl点于尼龙膜上，同时对照也对应点上。(2)在烤箱中120"C烤30分钟，使核酸固定在膜上。(3)将膜转移至含20mlbufferI的塑料器皿中，在15—25℃孵育下摇动2分钟。(4)在10mlbufferII中孵育30分钟。(5)在10mlBufferIII中孵育30分钟，或更长至60分钟。(6)用10ml冲洗液(bufferI)冲洗2×15分钟。(7)在10ml检测液中平衡2—5分钟。(8)在新鲜配制的BufferV中孵育(在黑暗条件下)，不能摇动。(9)当斑点出现后终止反应，用无菌蒸馏水冲洗5分钟。分析：5—10分钟出现斑点为30pg点，30分钟出现斑点为3pg点。4．7Dig-DNA探针原位杂交操作步骤：(1)O．1MPBS(PH7．2)／DEPC漂洗5minx3，(2)0．1M甘氨酸／0．1MPBSDEPC漂洗5min，(3)0．3％TritonX．100／0．tMPBSDEPC漂洗15min，(4)PK(199／m1)室温消化20min，(5)4％PFA漂洗5minx2，(6)O．1MPBS冲洗3minx2，(7)用现配O．1MTris—Hcl(PH8．0)含0．25％7,酸酐漂洗10min，(8)2×SSC漂洗10min，(9)Dig—DNA探针变性：沸水中10min，立即放入冰／NaCl中10min，(10)杂交：取标记好的Dig—DNA探针(杂交液稀释)，滴在切片标本上，43℃杂交20小时。(11)4xSSC漂洗，37"C，15min，(12)2xSSC漂洗37℃，30min，(13)1×SSC漂洗37℃，10min，04)O．5×SSC漂洗37"12，10min，05)O．05MPBS漂洗37。C，5minx3，(16)anti—dig—AP0：1000)，37。Clhr后在2xSSC的湿盒中4。C过夜，17 第三军医大学博士学位论文(17)0．05MPBS漂洗5minx4，(18)TSMl5min×2，(19)TSM25minx2，(20)显色：肉眼观察切片显兰色时终止显色(闭光，室温20min或4hr内)。f21)0．05MPBS漂洗5min，(221脱水、透明、封片。(三)毛囊bulge细胞的培养与鉴定1．标本来源：Wistar大鼠：鼠龄7．8天，体重10—159，雌雄不限，由本校实验动物中心提供。2．毛囊bulge细胞的分离培养和传代：无菌条件下取7日龄Wistar大鼠触须部皮肤，在含双抗(青链霉素)的D—Hank’S液中清洗两遍，在体视显微镜下用27号针头将毛囊从组织中分离出来，置于0．25％Dispase消化液中，4。C消化2小时后用D—Hank’S清洗，在体式显微镜下轻轻挤压毛球部即可将毛囊外根鞘及毛干完整地分离出来，切去皮脂腺及毛囊中下段，保留Bulge区毛囊。将分离出的毛囊Bulge区组织置于添加5％胎牛血清的K．SFM培养基，37。C，5％C02的条件下使其贴壁生长，每2．3天换液一次，并逐渐降低血清浓度，直至无血清培养。当细胞接近80％融合时，用含O．125％胰蛋白酶和0．01％EDTA的消化液消化，并将细胞悬液置于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37"C静置15分钟后，将上清吸出，并用D—Hank’S洗涤培养瓶底两遍后，加入K—SFM培养基继续培养。3．毛囊bulge细胞的生长特性观察：在倒置显微镜下直接观察活细胞的生长状态4．毛囊bulge细胞的鉴定：4．1将细胞直接接种于盖玻片上，待细胞长出后，以丙酮固定10min，依照免疫组化操作步骤检测K19的表达，具体步骤如下：(1)取出细胞片，PBS清洗后，丙酮固定10min；(2)PBS洗涤2x3min；(3)滴加O．3％H202一甲醇，室温孵育15min以阻断内源性过氧化物酶；(4)PBS洗3x3min；(5)滴加二抗的正常血清封闭，室温孵育15min：(6)弃去封闭血清，勿洗：(7)加一抗，4"C过夜(以PBS代替一抗作阴性对照)；(8)PBS洗3×3rain；18 第三军医大学博士学位论文(9)加生物素化通用型二抗，37℃孵育30min；(10)PBS洗3×3min；(11)an-抗(SP)，37℃孵育30mira(12)PBS洗3×3min；(13)滴加DAB显色，镜下观察显色结果；04)自来水充分冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。4．2将细胞直接接种于盖玻片上，待细胞长出后，以丙酮固定10min，依照免疫荧光操作步骤检测a6一integrin及CD71的表达，具体步骤如下(1)用O．01MPBS洗10min两次(2)4％多聚甲醛固定10．20min(3)PBS洗3x5min(4)血清封闭60min(5)室温一抗孵育，或者4"C过夜。，(6)PBS洗涤3x5min(7)室温二抗孵育60rain(此步骤开始均需避光)(8)PBS洗涤3x5min(9)用缓冲甘油封片后，荧光或共聚焦显微镜观察，并拍照。5．毛囊bulge细胞生长曲线的绘制：将细胞接种于24孔培养板中，接种密度为1x104,培养48小时后，取3孔细胞常规细胞计数，求平均值，以后每24小时按同样方法计数，根据计数结果取对数绘制生长曲线图。6．克隆形成率(CFE)：取第l，2，3代细胞，以相同密度将Bulge细胞接种于48孔板中，每组各接种3孔，接种密度为2-5／mm2，置于3712、5％C02培养箱中培养10天，4％多聚甲醛固定，Gimsa染色，在倒置显微镜下计算克隆数(10个以上细胞为一个克隆)，取平均值计算克隆形成率，公式如下：克隆形成率=(克隆数+接种后活细胞数)x100％7．K19染色阳性细胞率：取第1，2，3代爬片培养的Bulge细胞，PBS漂洗3×5min，丙酮固定10min，然后循常规免疫细胞化学染色，在光镜下随机选取5个视野计算K19的阳性表达率，取其平均值比较。8．统计分析：实验数据以x：l：s表示，运用Excel统计软件对各组数据进行方差分析，以P<0．05为差异有显著意义。(四)不同培养基中毛囊bulge细胞的生长特性比较19 第三军医大学博士学位论文1．毛囊Bulge细胞的分组培养：无菌条件下取七日龄Wistar大鼠触须部皮肤，在含双抗的D—Hank’S液中清洗两遍。在体视显微镜下小心将毛囊从组织中分离出来，然后置于0．25％Dispase消化液中，4。C消化2h后用D—Hank’S液清洗。在体视显微镜下轻压毛球部，即可将毛囊外根鞘及毛干完整地分离出来。用27号针头切去皮脂腺和毛囊中下段，保留Bulge区毛囊。将分离的Bulge区毛囊分两种培养基培养①实验组：将分离的毛囊Bulge组织置于无血清的K．FSM培养基中，37。C、5％C02环境下使其贴壁生长，每2～3天换液一次，当细胞接近80％融合时，用含O．125％胰蛋白酶和O．01％EDTA的消化液消化传代。②对照组：将分离的毛囊Bulge组织置于DMEM／F12培养基中，37。C、5％C02环境下使其贴壁生长，待培养液颜色变黄(大概3天左右)即换液一次，以后处理同实验组。2．毛囊bulge细胞生长曲线的绘制：同前。3．克隆形成率(CFE)：每组取第1，2，3代细胞计算克隆形成率方法同前。4．K19染色阳性细胞率：每组取第1，2，3代爬片培养的Bulge细胞，观察K19的阳性表达率，取其平均值比较，方法同前。5．统计分析：实验数据以-y-4．s表示，运用Excel统计软件对各组数据进行方差分析，以P<0．05为差异有显著意义。结果一、K19、及K10在毛囊中的表达石蜡切片低倍镜下可见部分表皮和纵向排列的毛囊组织，K19染色阳性细胞位于表皮基底部及毛囊外根鞘和bulge区(图1-1A，B)，基底上层及毛囊内根鞘、毛干和真皮乳头均无着色。原位杂交检测K19mRNA在毛囊中的表达和蛋白表达区域基本相同，主要位于毛囊的外根鞘bulge区，毛囊内根鞘、毛干和真皮乳头未见表达(图1—2)。K10在毛囊中的表达主要位于内根鞘部位，而外根鞘的表达明显减弱(图1—3)。二、毛囊bulge细胞体外生长特性观察1．毛囊bulge细胞的生长状况：经酶消化后的毛囊bulge区细胞活力好，24h后即有80％细胞贴壁(图1．4)，细胞体积小、核大，核仁明显，细胞器少。3-4天后细胞出现融合，一周后细胞生长减慢，此时进行传代，继续培养细胞呈克隆生长(图l·5)，但传至4代时，细胞生长能力减弱。2．培养毛囊bulge细胞的鉴定： 蔓三至堕奎堂堕主堂垡笙塞————————————————————————————————————————————————————一fn免疫细胞化学检测结果显示，群集生长的细胞中有大量表达K19的细胞分布r图1-6)，棕黄色阳性表达位于细胞浆。传代后及随着培养时间的延长，阳性表达逐渐减弱，阳性细胞逐渐减少。f21免疫荧光细胞化学反应结果显示，大部分细胞同时强表达ct6整联蛋白(图1-7)而CD71表达较弱(图1—8)。3．毛囊bulge细胞生长曲线(图1-9)：细胞培养第1、2天生长缓慢，第3天开始迅速增殖，第7天左右进入平台期，此时开始出现接触抑制，细胞增长缓慢，继续培养，10天左右细胞开始出现老化。5484．6瓤薹4．4器4．243．812345617891011天数Figl一9GrowthCurveofrathairfolliclebulgecells图1-9毛囊bulge细胞生长曲线4．克隆形成率和K19阳性率：结果显示(图1．10)，传代后第1，3，5代细胞的克隆形成率分别为：85．2％-士2．6、66．5％士4．3和40．6％士6．9，K19阳性率分别为：93·30／硅3·1、76．5％士5．4和50．2％：L10．6，两者均呈明显下降趋势妒诱导后bulge细胞>同期培养的bulge细胞，而C／EBPIB的表达差异不大。免疫细胞化学的结果与此相似(图4．8，9，10)。M：markerIV；P：bulge-PPARy2cells；I：inducedbulgecells；B：bulgecellsFi94—7AExpressionofC／EBPainthreegroupcells图4．7AC／EBPa在三组组堕中的表达M：markerI：P：bulge-PPARV2cells；I：inducedbulgecells；B：bulgecellsFi94-7BExpressionofPPARV2inthreegroupcells图4．7BPPART2在三组细胞中的表达48 第三军医大学博士学位论文M：markerIV；P：bulge-PPARr2cells；I：inducedbulgecells；B：bulgecellsFi94—7CExpressionofC／EBP[3inthreegroupcells图4—7CC／EBPp在三组细胞中的表达M：markerIV；P：bulge-PPAR72cells；I：inducedbulgecells；B：bulgecellsFi94—7DExpressionofG3PDHinthreegroupcells图4-7DG3PDH在三组细胞中的表达讨论过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator．activatedreceptor，PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，1990年Issemann等(69)首先发现了一种新的甾体激素受体，它能被一类脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeproliferators，PP)激活，而被命名为PP激活受体。根据结构的不同，PPAR可分为Ⅱ、13(或6)和Y三种类型，其中PPAR7主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(troglitazone，TZDs)作用的靶分子。PPAR的三种亚型参与脂肪细胞分化作用的时相及程度各有不同，通过转染具有分化成脂肪细胞潜能的多种细胞系进行评价，PPAR7的成脂作用最强(70)。PPAR7具有脂肪组织特异性，能被脂肪酸及外源性过氧化物酶体增殖荆激活，而调控某些参与脂质代谢的酶的表达(71)。PPAR7在许多脂肪细胞基因转录激活前被诱导，对细胞分化有重要作用(7舶。Rosenfield等(5I发现PPAR7激活剂和DHT能促使皮脂腺细胞分化，两者作用叠加，但是单纯使用雄激素诱导皮脂腺分化效果不佳，添加PPA脚激动剂后，皮脂 第三军医大学博士学位论文腺细胞出现明显分化。进一步研究发现PPAR7与RXR(retinoidXreceptor)协同作用能促进皮脂腺细胞的发育和分化(7孙。在体外研究中，胚胎干细胞诱导分化为脂肪细胞依赖于PPA脚的参与，通过对PPARY阳性嵌合体小鼠和野生型小鼠研究证明，PPA聊为皮脂腺细胞的分化所必需。本实验发现，PPA脚在毛囊中的表达主要位于毛囊内根鞘、皮脂腺，毛囊的外根鞘基本不表达PPA斟。同时发现，PPA脚在大鼠毛囊bulge区的表达是不均一的，靠近皮脂腺的区域PPAR7的表达明显增强，而在其下方距离皮脂腺较远部位的bulge细胞不表达或弱表达PPAR7。我们知道，毛囊bulge细胞具有多向分化的能力，它不仅可以分化为毛囊自身的细胞，还能够分化为皮脂腺和表皮细胞。目前研究发现，干细胞的分化和发育与其所处的微环境(niche)密切相关。微环境在维护干细胞的自我更新，决定干细胞分化命运方面有重要意义。微环境通过给予干细胞一定的信号来调节细胞内基因的表达与关闭，从而决定细胞的分化方向。我们试图寻找决定bulge细胞向皮脂腺分化的关键信号，而PPAR7有可能是bulge细胞向皮脂腺分化的关键因子。在PPA斟的三种亚型中，PPAR72与脂肪和皮脂腺细胞的分化尤其相关17”。PPAR72是脂肪细胞分化过程中重要的调节因子，它可促使成纤维细胞或骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化‘7孙。Ren等‘76’通过基因敲除的方法研究表明是PPAR72而非PPAR71在脂肪分化的过程中起着至关重要的作用。有研究认为PPAR71和PPAR72均能有效刺激脂肪细胞的分化，但在低配体浓度的情况下，PPARV2刺激脂肪组织形成的能力明显强于PPARyl(771。PPAR72是脂肪细胞分化过程中重要的调节因子，它可促使成纤维细胞或骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化(78,79)。毛囊bulge细胞能够低丰度表达PPA脚2，所以无须导入任何基因，细胞也能向皮脂腺方向分化，本实验也观察到这一现象。但是由于bulge细胞是多向分化的，加之内源性PPAR72的表达并不强烈，所以只有很少的细胞分化成为皮脂腺细胞。我们将外源性PPARY2基因导入bulge细胞中，增强它的表达，结果发现转染PPAR72组细胞脂滴合成、EMA表达的阳性率均明显高于未转染组，说明了PPARy2能够有效地促进毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞分化发育。皮脂腺细胞的分化过程十分复杂，包括细胞形态的改变及基因表达谱的变化。脂质的合成和聚集是皮脂腺细胞分化过程中重要标志之～，早先发现，转录因子CCAATT增强子结合蛋I刍(C／EBPs)和PPAR7是调控脂质合成的最重要的因素，两者协调作用促进脂肪细胞的分化(80)，如图4—8所示，PPA脚在脂质合成的转录调节中发挥着重要的作用。在脂肪细胞分化的早期阶段，外源性激素诱发的C／EBPl3的短暂性表达，引起PPARY50 第三军医大学博士学位论文的表达和活化，随后发生C／EBPa的表达和终末期分化，而C／EBPa和PPART之间存在交叉调节，相互激活，形成环路，从而促进脂肪细胞的分化。那么在bulge细胞向皮脂腺细胞的分化过程中是否也存在类似现象呢?我们观察了不同组别细胞的PPART2、C／EBPct、B表达的差异，发现已经分化为皮脂腺细胞的两组细胞PPA聊2、C／EBPa的表达明显增强，而三组细胞C／EBP[3的表达没有明显变化，这也说明bulge细胞向皮脂腺细胞分化的路径和脂肪细胞分化有些类似。曼，。≥，PJ0lAR，+RXRa一伽，。O腧肪细胞特异性婪埘最远及分化附图2成脂过程中转录因子相互作用示意图．●h皮脂腺细胞的发育分化过程十分复杂，包括细胞形态的改变和基因表达的变化。尽管已知在体的毛囊bulge细胞能够向皮脂腺细胞分化，但是由于bulge细胞的分离培养技术相对滞后，导致缺乏体外观察bulge细胞向皮脂腺细胞分化的直接证据。本实验首次在体外将毛囊bulge细胞诱导分化为皮脂腺细胞，并首次通过脂质体将目的基因整合至lJbulge细胞基因组中，使之稳定表达，发现YPPART2基因在bulge细胞向皮脂腺细胞分化发育过程中起着重要的调节作用，从而为进一步研究毛囊bulge细胞和皮脂腺细胞的分化机制奠定了实验基础。本部分实验主要研究了PPART2对bulge细胞向皮脂腺细胞分化的影响，主要结果和结论如下：1．PPART在大鼠毛囊bulge区表达具有差异性，靠近皮脂腺区的bulge细胞表达明显增强，说明PPARV对bulge细胞向皮脂腺分化有着重要作用。2．转染了PPAR了2的bulge细胞胞的脂滴合成、EMA表达阳性率均明显高于未转染组，说明能够有效促进bulge细胞向皮脂腺细胞的分化。3．PPART2和C／EBPa、B的协同作用是bulge细胞向皮脂腺细胞分化的重要调节因素。 第三军医大学博士学位论文致谢值此论文完成之际，首先衷心地感谢恩师杨恬教授对我的培养和帮助。本论文得以顺利完成与导师的悉心指导、严格要求和大力支持密不可分。导师的谆谆教诲激励我不断进取，导师严谨的治学作风，兢兢业业的工作态度，使我获益良多感谢我的同窗高强国博士，感谢他为我分担实验的彷徨与困惑，帮助我解决技术难关；感谢他和我一起筹划课题的进程，帮助我完成实验。感谢我的爱人余瑾硕士和弟弟符强硕士，三年来，他们始终陪伴着我，在生活上关心照顾我，在学习和工作中不断帮助我、鼓励我，使我有充足的精力投身论文实验工作。感谢第三军医大学生化教研室江渝教授馈赠质粒，感谢分子遗传教研室黄刚博士和浙江大学医学院陈敬博士在引物设计、质粒的构建和转染等方面为我提供的无私的帮助。在实验的过程中，还得到了连小华教授、曾益军高级实验师的帮助，使我的实验能够顺利完成。在课题的进行中，还得到细胞生物教研室王韵博士、张艺博士、杨珂博士、杨迸硕士、金曼硕士、徐远旭硕士、李远宾硕士、林森硕士、严军博士后、崔志鸿博士后、张诚博士、李习玲硕士、陈永群师傅、胡玉兰师傅以及免疫教研室陈永文博士、吕燕波博士、西南医院眼科姚军平博士、病理科王长松博士、烧伤科孙荣距博士、四川大学医学院生理教研室成敏博士、重庆大学黄恩毅硕士，还有遵义医学院张信江教授、德国柏林自由大学ChristorsC．Zouboulis教授给予的不同程度的帮助，在此致以诚挚的谢意。最后，特别感激我的父母、岳父母，他们给予我的理解、支持和鼓励是我完成学业的基础。 笙三至垦盔堂堡主堂垡笙壅一———————————————————————————————————————————————一昭，llI．LLPi53 第三军医大学博士学位论文Figl-IAExpressionofKl9inrathairfolliclebyIHC(×100)图1-1A免疫组化K19在大鼠毛囊中的表达Figl·IAExpressionofKl9inadulthairfolliclebyIHC(×100)图1．1B免疫组化K19在人毛囊中的表达 第三军医大学博士学位论文Figl-2ExpressionofKl9inadulthairfolliclebyISH(×100)图1．2原位杂交K19在人毛囊中的表达Fi91·1AExpressionofKl0inadulthairfolliclebyIHC(×100)图卜3免疫组化K10在人毛囊中的表达 第三军医大学博士学位论文1Figl一4Primarycultureofrathairfolliclebulgecells(invertmicroscope×loo)图1—4原代培养的毛囊bulge细胞图l-5克隆生长的毛囊bulge细胞 笙三至堕奎堂堂主堂鱼丝兰Figl一6ImmunocytochemicalstainingofKl9inrathairfolliclebulgecellsr×200)图I-6K19表达阳性的bulge细胞Figl-7Immunofluorescencestainingofa6integrininbulgecellsf×200)图1．7免疫荧光细胞化学检测bulge细胞表达n6整联蛋白57 第三军医大学博士学位论文Figl-7lmmunofluorescencestainingofCD71inbulgecqs(×200)图l-7免疫荧光细胞化学检测bulge细胞弱表达CD71Fi92—1Morphologicchangesofratfolliclebulgecellsafterinduceculturedfor3weeks(×200)图2-1诱导培养三周后bulge形态的变化58 。第兰军医嚣攀搏辞位铥文、。、hj肆々。·#。。。、彰二t一～一i口。“n；F。i92-2Posit晦expressionof6ilred。，oin譬h掰foihcle⋯buige，ceiis础打in—ituceculturedfol73口～‘‘j，{j■，week交x400i。。‘’。t图2．2诱导培养三周bulge油红0染色阳性墓ig务3Imm曲。沥c矗两ic；；Il鳓箝鲢j粪琶衄A二蘸蛹19皂嗣姆8毋indu”I；ll[鎏20噬√j誓；_。_‘M。。冀。。鼍4。、～√x4、图皇．3免疫细胞化学检测蘑导后细胞奏达曼MAc 第三军医大学博士学位论文Fi92—4NegativeexpressionofEMAinnoninducedbulgecellsr×200)图2—4未经诱导培养EMA染色阴性Fi92-5ImmunocytochemicalstainingofPPARYinbulgecellsafterinduced(×200)图2-5经过诱导培养的毛囊bulge细胞表达PPAIh蛋白 笙三垩垦盔堂壁主堂垡笙茎————————————————————————————————————————————一Fi92．6ImmBnocytocheroicalstainingofPPAR7innoninducedbulgecells(×200)图2．6未经过诱导培养的毛囊bulge细胞PPAR7蛋白表达弱阳性Fi93．3Positiveexpression0fEGFPinrathairfolliclebulgeceIIstransfectedwithpEGFP_PPAR了2plasmid(FluorescemmicroscopeX200)图3-3bulge细胞转染EGFP后表达绿色荧光61 第三军医大学博士学位论文Fi93—5lmmunocytochemicalstainingofPPARyinbulge—PPART2cells(×200)图3-5bulge细胞转染pEGFP-PPART2质粒后表达PPA聊蛋白Fi93—6ImmunocytochemicalstainingofPPAR7innon-tranfectedbulgecellsr×200)图3-6未转染质粒的bulge细胞弱表达PPARV蛋白 ．兰三至垦奎堂堕主兰垡笙茎一一Fi94一lLeft：ExpressionofPPARyinrathairfolliclebyIHC(×loo)Right：ExpressionofPPAR7inratsebaceousglandsbyIHC(×100、图4-1免疫组化检测PPAR't在大鼠毛囊中的表达Fi94．2Lipiddropletscouldbeseeninbulge—PPAIh2cellsafterinduced(×200)图4-2转染PPAR72质粒bulge细胞经诱导培养后有较多脂滴 第三军医大学博士学位论文Fi94—3Lipiddropletscouldnotbeseeninbulge-mockcellsafterinduced(×200)图4-3空质粒转染bulge细胞形态和实验组类似但未见脂滴的合成Fi94-4PositiveexpressionofoilredOinbulge-PPAR'／2cellsafterinduced图4-4经诱导培养转染PPAR'12质粒bulge细胞油红O染色 第三军医大学博士学位论文Fi94·5lmmunocytochemicalstainingofEMAinbulge—PPARr2cellsf×200)图4-5转染PPARr2质粒bulge细胞经诱导培养后EMA染色Fi94—8ImmunocytochemicalstainingofPPARrinbulge—PPARr2cells(×200)图4-8转染PPART2质粒bulge细胞经诱导培养后PPARy染色 第三军医大学博士学位论文Fi94—9AlmmunocytochemicalstainingofC／EBPainbulge-PPAR_2cells(×200)图4—9A转染PPAmE质粒bulge细胞诱导培养后C／EBPu染色Fi94—9BlmmunocytochemicalstainingofCEBP／ainbulgecellsafterinduced(×200)图4．9B经过诱导培养的bulge细胞C／EBPa染色 第三军医大学博士学位论文Fi94·9CImmunocytochemicalstainingofC／EBPainnoninducedbulgecells(×200)图4．9c未经诱导培养bulge细胞C／EBPa染色Fi94—9AImmunocytochemicalstainingofC／EBPl3inbulge·PPARr2cells(×200)图4-10A转染PPAR72质粒细胞诱导培养后C／EBPD染色67 第三军医大学博士学位论文Fi94—10BImmunocytochemicalstainingofC／EBPIBinbulgecellsafterinduced(×200)图4-10B经过诱导培养的细胞C／EBPp染色Fi94·10CImmunocytochemicalstainingofC／EBPpinnoninducedbulgecellsf×200)图4-IOC未经诱导培养bulge细胞C／EBPp染色 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第三军医大学博士学位论文文献综述一PPARy研究新进展过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator—activatedreceptor，PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员【lJ，1990年Issemann等【2】首先发现了这种能被一类脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeproliferators，PP)激活，而被命名为PP激活受体(peroxisomeproliferatoractivatedreceptor，PPAR)。根据结构的不同，PPAR可分为a、13(或6)和T---种类型，其中PPART主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(troglitazone，TZDs)作用的靶分子，成为近年来研究热点。1．PPAR7的结构及特征PPARy基因位于3号染色体短臂上【3l，含有9个外显子。由于基因转录时所用的启动子和接拼方式的不同，PPARy可以分为T1、T2和T3三种亚型，其中Y3和T1编码的蛋白质相同14,51。PPARy2编码的蛋白质由505个氨基酸组成，ELPPAR71在氨基端多30个氨基酸。进一步研究发现【6】，PPARVlmRNA是由8个外显子编码，而PPAR72mRNA由7个外显子编码，编码的氨基酸数量虽有不同，但两者PPAR7的结构域、DNA结合域及配体结合域等完全相同，作用基本相同。研究发现，不同种属间PPAR7cDNA具有高度同源性，如人与小鼠的PPARTl的一致性达9l％17J。在啮齿类动物中，PPARy主要在脂肪组织中表达，而在人体，除脂肪组织外，在巨噬细胞以及其他脂肪贮存细胞，如肝、肾、肺及直肠中均有表达，并且人肝组织比鼠肝表达更为丰富，而肌肉组织基本不表达。PPAR71是PPAR7的主要形式，表达范围相对广泛，PPAR72表达范围较窄，主要在脂肪组织中表达，PPART3仅表达于巨噬细胞和大肠中[8,91。2．PPAR7的配基和功能PPAR7的配基(又称激动剂)有两种，生理性配基和药理性配基。生理性配基有15．脱氧前列腺素J2(15d．PGJ2)及其代谢产物和不饱和脂肪酸等，药理性配基有胰岛素增敏剂噻唑烷酮类化合物(TZDs)，它是PPARV的高效配基。随着研究的不断深入，越来越多的配基不断被发现，Lehmann等报道吲哚美辛等非甾体类抗炎药也能与PPARy结合并使之活化【10】，此外胰岛素可活化PPARy，大鼠脂肪细胞经胰岛素处理30min后，能 第三军医大学博士学位论文使其磷酸化水平增}J113倍，显示PPA脚活性升蒯11】。配基与PPARr结合后，可激活PFARv并调节目标基因的转录活性。PPART的N端功能区含有一个能被有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位点，若该区域突变或在磷蛋白磷酸酶共同作用下则不能产生磷酸化而使其活化【l“。配体与PPARv结合并使之激活后，与视黄醛x受体a(retinoidXreceptorⅡ，RXRa)形成异二聚体，再结合于特异性DNA序列而使靶基因活化，此序列称为PPAR特异性反应元件(peroxisomeproliferatorresponsiveelement，．，PPRE)【13，14】。PPARv还能影响NFrd3、信号转录子、激活蛋白一l介导的信号通路，通过抑制这些途径的激活达到抑制靶基因启动子激活和转录的目的。含有PPRE结构的基因包括已酰辅酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰岛素受体底物．2(IRS．2)、瘦素以及肿瘤坏死因子一Ⅱ(TNF-a)等Il”。PPARr通过调节相关基因的表达，在脂肪形成、糖脂代谢，以及在免疫系统中发挥重要作用，并与多种疾病如糖尿病、肥胖、高血压、癌症等的发生、发展有关。尤其是PPARV是脂肪细胞分化过程中的关键因子，近年来备受关注。3．PPARl'和成脂细胞的分化tPPAR的三种亚型参与脂肪细胞分化作用的时相及程度各有不同，通过转染具有分化成脂肪细胞潜能的多种细胞系进行评价，PPART的成脂作用最强【l“。PPART具有脂肪组织特异性，能被脂肪酸及外源性过氧化物酶体增殖剂激活，而调控某些参与脂质代谢的酶的表达。PPAR7在许多脂肪细胞基因转录激活前被诱导，对细胞分化有重要作用【l”。胰岛素、糖皮质激素以及胞内CAMP的诱导剂可使前脂肪细胞分化成脂肪细胞，而表皮生长因子(EGF)、转化生长因子可抑制原代培养及前脂肪细胞系的分化同时有丝分裂原活化的蛋白激酶可以使PPARy磷酸化，抑制了配体的转录活化功能，提示：PPAR7的转录活化作用可受到参与脂肪细胞分化过程中细胞因子的信号传导途径的调节Il⋯。在体外研究中，胚胎干细胞诱导分化为脂肪细胞依赖于PPA聊的参与，通过对FPART阳性嵌合体小鼠和野生型小鼠研究证明．,PPAR7为皮脂腺细胞的分化所必需。在rPARv的三种亚型中，PPARY2与脂肪和皮脂腺细胞的分化尤其相判18】。PPARv2是脂肪细胞分化过程中重要的调节因子，它可促使成纤维细胞或骨髓问充质干细胞向脂肪细胞分化[191。Rent20l等通过基因敲除的方法研究表明是PVARr2而非PPAR7l在脂肪分化的过程中起着至关重要的作用。有研究认为PPARYI和PVART2：均能有效刺激脂肪细胞的分化，但在低配体浓度的情况下，PPAR了2刺激脂肪组织形成的能力明显强于PPARvl【2”。PPA脚在皮脂腺细胞分化过程中同样扮演极为重要的角色[22,23]。在体外用雄激素诱导皮脂腺分化很难达到预期效果，其原因可能在于缺乏促分化因子，Rosenfield等【24】发现77 第三军医大学博士学位论文PPAR7激活剂和DHTfl＆促使皮脂腺细胞分化，两者作用叠加，但是单纯使用雄激素诱导皮脂腺分化效果不佳，添力[IPPAR7激动剂后，皮脂腺细胞出现明显分化。进一步研究发现PPARy与RXR(retinoidXreceptor)协同作用能促进皮脂腺细胞的发育和分化125,26]。。4．PPAR7与肿瘤过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR是细胞核激素受体，它转录水平影响脂肪酸及其衍生物的功能。通过以上的方式，PPAR可以调节细胞的分化、增殖和生存，从而在不同组织中控制癌症的发生。但是每种PPAR亚型和癌发生有何关系呢?并且这些发现和人体病理学及治疗有何关系呢?PPAR了具有抗增殖及预调亡和促分化的功能[271因而具有较全面的抗癌活性。PPAR7参与了前脂肪细胞分化成脂肪细胞以及单核细胞分化为巨噬细胞。当有PPA脚和RXR配体存在时，骨髓细胞前分化为静息巨噬细胞，当两者持续存在时，PPAR7可消退脂肪瘤细胞分化同时触发瘤细胞向脂肪细胞分化【2”。实验发现PPAR7在正常结肠细胞、高分化及低分化肠癌细胞中均高表达【2⋯。PPAR7选择性配体曲格列酮可抑制人结肠癌细胞及乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖、诱导其分化，并可使裸鼠模型中肿瘤体积缩d、50％，减少平均荷瘤数13⋯。溃疡性结肠炎与结肠癌的发生密切相关，NSAIDS可作为PPAR7配体发挥作用PPAR7激动剂可抑伟qcox一2的表达，同时PPAR7激动剂可抑制巨噬细胞的激活、炎性细胞因子的生成，可抑制炎症及致瘤损伤的进展13”。目前曲格列酮己进行II期临床用于乳腺癌和前列腺癌的治疗，临床研究发现PPA脚激动剂对胰腺癌有较强的抑制作用，已完成I期临床试验【32】。He等【33】研究发现，体外正常培养的大鼠角朊细胞不表达PPAR7，但是PPAIh的激动剂TZDfi＆够通过抑制细胞的CyclinDl的表达，从而抑制其增殖并促其分化，作者认为，TZD可能作为一种有效的药物参与皮肤癌的治疗。关于PPART抗肿瘤作用机制，目前认为PPAR7能降低凋亡抑制因子NF．KB的活性；减少凋亡抑制基因的C．myc的表达；调控与细胞迁移有关的因子的表达：E一粘连蛋白、桥粒芯糖蛋白、p27、B一连环蛋白；调节促血管生长因子VEGF的表达。在将来，PPA脚可能还有PPARp／6能成为肿瘤治疗的诱人的靶点。但是在临床和科学方面的还需作进一步研究。5．PPAR7jfn免疫PPARY的配体15d—PGJ2在许多免疫应答中起调节作用，PPAR7存在的情况下，极低浓度的15d．PGJ2就可以抑制脂多糖诱导的经由AP．1(Activeprotein21)、NF-r．B、STATl(signaltransducerandactivatoroftranscription11介导的转录效应。PPARY通过与NF—r．B间蛋白．蛋白相互作用，阻止NF．rB与炎症因子基因启动子区的同源顺式元件结厶【34】。Yang等发现15d．PGJ2与格列酮类均能通过活化的PPAR7而抑$1JPHA诱 第三军医大学博士学位论文导的人T细胞增殖及IL．2基因表达，抑制活化的T细胞与IL一2启动子中同源顺式元件相结合。PPA勋在调节诸如单核P巨噬细胞、T细胞及NK细胞等免疫细胞的分化中有重要意义【351。PPAR7配体通过PPA脚依赖P非依赖途径抑制T细胞及NK细胞产生IFN2yt36】。基因芯片技术结果显示PPA聊在2型T细胞中表达要明显强于1型T细胞(大约5～8倍)。2型免疫细胞在培养条件下(加用IL．4及IFN—T抗体)可诱导人NK细胞表达PPAR7t”1。活化的PPART可介导抑制单核细胞炎症因子TNF一Ⅱ，IL．1，IL．2和IL．6的生成，产生抗炎症作用。T淋巴细胞活化的关键是控制淋巴细胞早期分化反应的IL．2基因的表达。PPAR7活化后可抑StJIL．2基因表达从而抑制人T淋巴细胞的早期活化【381。提示PPAR7配基可通过IL一2基因表达治疗T细胞介导的疾病，并具有临床潜力【391。有关PPA脚的研究报道已经有很多，但仍有许多问题尚待深入研究，如PPAR7在脂肪细胞增殖和分化中的确切作用，以及该受体如何同辅助因子相互作用激活转录，如何有选择性地控带gPPAR?介导的生物学效应等。目前人们正致力于探讨干预PPAR7基因转录和影响PPARY蛋白功能的药物及其作用机制，若能全面地揭示PPAR7功能，则将对肥胖、糖尿病、肿瘤等疾病的治疗大有益处。 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第三军医大学博士学位论文文献综述二绿色荧光蛋白在肿瘤及干细胞研究中的应用绿色荧光蛋I刍(GreenFluores2centProtein，GFP)基因最早是由ChalficIll等在研究维多利亚水母(AequoreaVie2toria)发光现象过程中分离纯化来的，由于其荧光稳定，检测方便，对活细胞无伤害等优点，已被作为一种标记基因(MarkerGene)广泛应用到生物学的各个领域。绿色荧光蛋白的cDNA约740bp，编码238个氨基酸残基，分子量为27x103t21．GFP的一级序列由cDNA序列推导出来【3】’GFP的生色基团位于64～69的六肽内。1974年得到GFP的结晶，1988年报道了衍射图谱，1996年解出了结构【4】。GFP的立体结构是由两个相当规则的内含一个Ⅱ一螺旋和外面包围11条p桶状结构(13一barrel)组成的二聚体【5】，6．折叠形成桶状结构的外围，桶状结构和位于其末端的短Q一螺旋以及环状结构一起组成一个致密的结构域，生色基团位于螺旋中部。GFP的生色基团由位于65～67位的3个氨基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸．甘氨酸形成的对羟基苯咪唑啉酮构成，当受到紫外或蓝光激发时，最大激发波长为395nm，并在470nm处有一肩峰，其荧光发射峰为509nm。近年来，用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)和羟胺突变等方法产生GFP突变型，在一定的波长下发出黄色光，如生色团中酚盐阴离子后加一个芳香环的变种GFP。虽然529nm处荧光呈绿色，但在拖尾峰更长的波长处却产生黄色荧光，己被命名为黄色荧光蛋白(Yellowfluorescentprotein，YFP)，而在Y66HGFP变种的生色团中加入一个咪唑基可发射蓝色荧光，称其为蓝色荧光蛋白(bluefluorescentprotein，BFP)I“。双突变体Y66H／Y145F能在381nm光的激发下产生455nm的蓝光，故称之为蓝色荧光蛋I兰I(BFP)。此外，这种蓝光还能进一步激发GFP产生绿色荧光。这种现象称之为荧光共振能量转移(fluorescenceresonantenergytransferring，FRET)¨1。利用FRET不仅可以研究蛋白之间及细胞器之间的相互作用，还可以检到蛋白亚基间的相互接近。红移型绿色荧光蛋白(red．shiftedgreenfluorescentprotein，RSGFP)：组成GFP氨基酸序列中第64～69残基依次突变即可产生RSGFP，其中一个突变体RSGFP4也具有单一激发光谱(490nm)，但其荧光强度较WTGFP高4倍。在RSGFP4基础上进一步改造，可得新型突变体——红色荧光蛋I刍(Redfluorescentprotein，I强P)。利用HFP和RFP标记不同的蛋白质就很容易在荧光显微镜下将它们区别开来，也可用此特点对细胞内不同细胞器进行标记来研究其相互作用。此外，RFP和BFP之间亦84 第三军医大学博士学位论文可发生FRET现象，因此，为不同蛋白之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。一、绿色荧光蛋白的特点①GFP分子量小，蛋白性质极为稳定，转染细胞后，不影响目的基因的表达及目的蛋白的结构和功能，对细胞无毒性作用，②易于耐受高温等处理，无光漂白作用，用甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光特性，能够在异源细胞中稳定表达，⑧无须辅助因子或共反应因子加入即可在紫外光或蓝光激发下发射荧光，且在450～490nm蓝光激发下，GFP至少能保持10min以上。而以往的标记基因多使用荧光脂酶(Lu2ciferase)，荧光检测需加辅助因子，且操作繁琐，价格昂贵。利用GFP发荧光的特性检测极为方便，普通荧光显微镜即可检测，应用激光共聚焦显微镜效果更佳，④还可用流式细胞仪对GFP阳性细胞进行筛选，以获得高表达目的基因的细胞株而对细胞无伤害作用【8l。⑤突变蛋白可显著改善荧光特性。目前作为标记基因应用较多的是GFP的两个突变体，$65T(65位丝～苏)和EGFP(64位苯丙～亮)，它们的激发峰波长可偏移到488nm，反射出的荧光强度要比野生型大6倍以上。这主要是突变型的蛋白表达量增加以及有效的蛋白折叠，使‘它能很快形成发色基因构型，所以$65T和EGFP比野生型GFP更适合作为一种报告：基因来研究基因表达、调控、细胞分化、及蛋白在生物体内的定位等。GFP在哺乳动物细胞系，尤其在肿瘤细胞高表达，为示踪肿瘤细胞定位、归宿提供了直观而有效的工具。传统的病毒感染检测及定位研究主要采用组织印渍法、放射性核酸探针法或将gus等报告基因引入病毒基因组作为标记等，但这些方法均必须在分析前对组织进行固定等处理，因而阻止了感染过程的继续。新型报告分子GFP克服了上述缺点，可用其对生活状态下的细胞进行实时、非破坏性地跟踪，观察病原微生物对宿主的感染轨迹，从而研究病原微生物与宿主细胞之间相互作用关系。Casper等19]将GFP基因插入烟草花叶病毒(Tobamovirus，1Mv)的基因组中，用该病毒感染的烟草叶片在紫外光下可观察到绿色荧光区域。二、绿色荧光蛋白在肿瘤研究中的应用1．在肿瘤发病机制研究中的应用GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。如乙型肝炎病毒的x基因为调控基因，影响着乙型肝炎发展、预后，并与肝癌的发生密切相关。用GFP转染x基因，发现乙型肝炎病毒感染的肝细胞，不管其处于什么周期，x蛋白主要定位于 第三军医大学博士学位论文细胞质，与胞液蛋白酶共同分布，其中一部分紧紧地附着在核膜上。据此推测x蛋白是通过蛋白酶体影响肝细胞的功能。在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，若过表达，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。Wong等【l0l在研究凋亡与肿瘤转移形成的关系中发现，bcl22过表达的瘤细胞，经周围静脉注入后，肿瘤细胞在肺脏内增殖活跃、凋亡减弱，易于形成转移灶。用GFP转染含或不含有某种凋亡调控基因的肿瘤细胞，并对这些肿瘤细胞在体内的生物学行为进行观察，可确定这种凋亡调控基因的功能。Var曲ese等⋯】用含ras基因的PAP2肿瘤细胞和不含ras基因的NIH3T3肿瘤细胞分别注入小鼠的门静脉，结果显示PAP2细胞在肝窦内异常增殖，而NIH3T3细胞因凋亡而难以形成转移灶。提示ras基因具有抗凋亡的作用。肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。何诚等【12】为研究nm232H1对肿瘤细胞侵袭能力的影响，将nm232H12GFP分别转染95D、95C人肺巨细胞癌，结果转染nm232Hl的95D、95C细胞体外侵袭能力明显低于未转染组。提示nm232H1具有抑制肿瘤细胞体外侵袭的能力。2．肿瘤生物学行为研究方面的应用研究肿瘤生长、浸润和转移的传统方法是将载瘤动物分阶段处死，做成光学或免疫组化切片进行观察，或采用CT、ECT、M刚、PET等影像仪器进行检测。为了详细了解肿瘤的生物学行为特征，即使使用大量的动物和昂贵的设备，也难以对肿瘤细胞的生长、瘤体形成过程进行连续、动态的观察。曾有报道将标记了荧光染料的肿瘤细胞经血管注射到动物体内，研究转移病灶形成过程，但由于标记后肿瘤细胞的荧光信号很易衰减，加上肿瘤细胞分裂，通常2～3d后便难以显示或跟踪经荧光标记过的肿瘤细胞[131。为了克服上述缺陷，Yang等【141建立了一种在活体内可连续、重复、动态观察肿瘤细胞生长及瘤体形成过程的方法。首先把GFP转染到肿瘤细胞上，然后原位移植至裸鼠体内，采用LZl2立体荧光显微镜，以D425P60、470DCXR双色滤片过滤后的蓝光作为激发源，直接观察活体内原位瘤的生长和转移过程，通过附于显微镜上的摄像装置摄像，图像同步输入计算机存储并分析，获取裸鼠全身瘤灶的影像。也可不利用LZl2立体荧光显微镜，而将裸鼠放入携有490衄蓝光的箱子里，通过(charge2coupledde2vice，CCD)相机直接摄像获得。采用这些方法，他们在体外观察到了脑、肺、纵隔、 第三军医大学博士学位论文肝、胃、肠、骨骼和腹腔淋巴结内的瘤灶。初步经验显示，荧光的强弱与肿瘤大小、深度有关，肿瘤位于皮下0．5mitt时，可检测到的最小瘤灶为59肛m；距皮下2．2mm时，能够检测到的瘤体约为1．8mm；深在部位的肿瘤，其所发出的荧光由于受周围组织，尤其是皮肤的干扰，，J、的瘤灶常难以显示。为此，Yang等【”】在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣，观察时打开皮瓣，建立一条荧光通路，大大提高了检测的敏感性，从而可检测出脑内、肝内单个肿瘤细胞，以及由数个肿瘤细胞形成的肺内微小瘤灶。3．检测肿瘤血管形成方面的应用肿瘤血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必备条件，如果没有新生血管供应营养，肿瘤达到1～2mm的直径将不再增大。因此，测定肿瘤内微血管密度(microvesseldentisity，MVD)，可以判断患者预后，通常测定MVD的方法是以抗血管内皮细胞抗体显示血管，计数阳性染色的新生血管数目。由于切片固定和脱水过程中可出现组织体积和形状的改变，采用免疫组化法获得的MVD值可靠性较差【⋯。Anna等‘171将GFP转染9L胶质瘤细胞后接肿于大鼠脑内，2周后处死大鼠，行鼠脑切片和荧光显微镜观察，无荧光标记的暗t叉(blockspots)为肿瘤血管区，由此计数肿瘤内的MVD。此法操作简便，结果可靠。最近，Yang等【11]将GFP分别转染PC3、Bx2PC3、MDA2MB2435前列腺癌细胞和Lewis肺癌细胞，然后原位移植至裸鼠体内，采用LZl2立体荧光显微镜对移植瘤进行适时观察，瘤内肿瘤血管在荧光的对照下异常清晰，可以在活体内动态监测肿瘤血管的形成和发展。4．在观测抗肿瘤疗效中的应用GFP作为一种报告基因，转染肿瘤细胞后，将随着肿瘤细胞的分裂、生长而传给下代，也将随着肿瘤细胞的死亡而消亡。根据这一特性，人们已将GFP应用于抗癌药物的疗效评价、肿瘤耐药机制的研究。Chambers等【181将GFP转染卵巢癌细胞SKOV3，在筛选出的阳性细胞内加入抗癌药物阿霉素，结果大部分肿瘤细胞荧光消失，并且证实失去荧光的肿瘤细胞均已死亡。随后的体内实验结果也与体外实验一致。Hoffmanllw用GFP转染的肿瘤细胞建立了10余种大鼠原位移植瘤模型，并己用于多种药物的疗效评价。这些模型不仅可以动态观察药物对肿瘤细胞生长的影响，还可以连续检测药物对肿瘤细胞侵袭和转移的影响，是进行新药筛选、药理作用探讨的标准模型，有望成为临床前和临床实验的桥染。5．GFP在肿瘤基因治疗中的应用肿瘤基因治疗的关键在于目的基因的高效转染和表达。既往常采用B2半乳糖苷酶、荧光素酶检测目的基因的转染和表达效率，但两者均有明显的缺陷。前者要求固定 第三军医大学博士学位论文组织或细胞，不能进行动态观察，此外，某些组织或细胞内存在内源性的B2半乳糖苷酶，可干扰检测结果；后者需要荧光素做底物，而荧光素随着时间的推移和肿瘤细胞的分裂会逐渐消失，通常2～3d后便很难显示被标记过的肿瘤细胞。GFP具有性能稳定、无需底物、能在活体内连续检测的特性，并已成为检测目的基因转染效率和表达方式的最佳报告基因[201。Flotte等‘2l】为了探索原位动态检测目的基因转染效率的方法，将Ad2CMv2GFP、AAV2CMV2GFP分别注入新西兰大白兔的支气管内，于转染后的第13、2l、30天，采用改装后能够检测绿色荧光的纤维支气管镜进行观察，并于第30天时处死动物行免疫组化对照分析，结果显示GFP能够准确地检测目的基因的转染效率。自杀基因治疗近年来在肿瘤细胞治疗策略中倍受青睐。其原理为将GFP基因与目的基因转染肿瘤细胞，使无毒性前体药物转变为毒性产物而杀死肿瘤细胞，利用GFP的荧光特性，可定量检测和分析载体的转染表达效率[12]。应用自杀基因(细胞色素CYP481)与GFP共转染胶质瘤细胞，体外实验证实，转染该基因的瘤细胞克隆在4一Ipomeanol(4一IM)的作用下，其半数致死量明显抵于未转染细胞克隆，且在一定范围内该基因表达水平与瘤细胞半数致死量呈负相关【2“。综上所述，GFP具有无毒、性能稳定、无需底物或辅酶和能在活体内动态观测等特性，为研究肿瘤的发病机制、生物学行为、血管形成以及评价抗癌药物的疗效和基因转染效率提供了一种简便可靠的观察方法。三、绿色荧光蛋白在干细胞研究中的作用1．干细胞迁移分化示踪干细胞研究中，表达GFP蛋白的供体干细胞+免疫组化染色的双阳性细胞可以提供干细胞的迁移、分化方面的证据。赵宇【23】等研究了绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)及其表达情况。发现48h后细胞转染效率为7％，G418筛选2周后约97％细胞出现抗性克隆，表达维持4周，证明基因转染细胞能够分化为成骨细胞，且不影响细胞的功能。2．目的基因对干细胞分化作用的研究将GFP与目的基因连接起来转染到干细胞中，可观察到目的基因的表达情况及相应干细胞形态和功能变化。张勇等将重组质粒plRES2．EGFP—MyoD用脂质体介导的方法转染到MSCs中，观察到GFP阳性细胞的形态变化及标志蛋白的特异表达，表明MSCs在质粒MyoD的调控下可以定向分化为成肌细胞。3．发育毒性机制研究一直以来在研究药物对胚胎发育毒性方面主要采用在体研究的方法，结果的观察 第三军医大学博士学位论文也主要是生理及形态学变化为主，但是无法动态地追踪施加药物后特定细胞分布和相关基因表达的情况。Paparella等【24】将GFP与内胚层细胞的特异标志物AFP(a一胎儿球蛋白)连接到一起，GFP基因作为报告基因。GFP基因的表达需要特异启动子也就是AFP的激活。将这种载体转染进未分化的胚胎干细胞细胞。施加化学药物，研究药物对AFP—GFP／D3胚胎干细胞克隆发育毒性影响。由于GFP与AFP表达部位一致，即可收集不同时间点细胞荧光图象进行图象分析，从而发现药物剂量、时间与胚胎龄和致畸部位之间的联系。综上所述，GFP报告基因的出现，使我们在不干扰活细胞功能的情况下，能直接观察蛋白分子的变化，结果可靠，操作简单、方便，费用低廉。预计今后利用GFP作为活细胞的分子探针，将广泛开展对基因表达调控、蛋白定位、运动变化、大分子之间的相互作用等各个方面的研究。 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