人肝微粒体cyp2a6和cyp2c9基因多态性对其药物代谢活性的影响

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1、万方数据AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectsofgenepolymorphismsofCYP2A6andCYP2C9ondrugmetabolisminhumanlivermierosomesBy：YanFangSupervisor：HailingQiaoPharmacologyBasicMedicalCollegeMay,2014万方数据原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内

2、容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。靴敝作耗专筘日期：砂J够年驴‘月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使

3、用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：亏牟乙日期：≯t中年6‘月日万方数据摘要人肝微粒体CYP2A6和CYP2C9基因多态性对其药物代谢活性的影响研究生方艳导师乔海灵郑州大学基础医学院临床药理学教研室河南郑州4500011细胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP)又称混合功能氧化酶和单加氧酶，是一类以血红素为辅基的b族细胞色素的超家族蛋白酶，其中CYP2A6和CYP2C9不仅分别参与临床约3％和15％药物的代谢，还能代谢和／或活化多种前致癌

4、物、前毒物及致突变剂。目前发现多种药物代谢酶含量和活性在个体间和种族问都呈现出显著的差异性，从而在对临床用药、环境化合物和前致癌物的毒性作用的敏感性上表现出个体差异。通常CYP酶的基因多态性可能是引起个体差异的主要原因之一。CYP2A6和CYP2C9基因具有高度的遗传多态性，以往的相关研究多在重组酶体系和人体体内展开，前者虽能较好的反映单一酶活性，但与人体内环境相差较远，后者虽接近人体内环境，但涉及药物体内处置的多个环节，不能单一反映代谢过程。综合来说，人肝是人体最为接近的体外代谢平台。本研究拟以肝功能正常的人肝标本为研究对象，考察基因多态

5、性对CYP2A6和CYP2C9代谢探针药物香豆素(coumarin，COH)和甲苯磺丁脲(tolbutamide，TOB)的影响，以期为临床合理应用经CYP2A6和CYP2C9代谢的药物提供理论依据。方法重人肝标本收集正常人肝标本108例，年龄20～75岁(中位数为47岁)。男性和女性万方数据摘要分别为36例和72例，有吸烟史和饮酒史的分别为12例和96例，用药史显示近期均未用明显影响CYP酶活性的药物。本试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。2C’删6和C即2仞的基因分型采用DNA提取试剂盒从肝组织中提取基因组DNA

6、。用CYP2A6、CYP2C9引物扩增含突变位点的基因片段，通过测序确定受试者的基因型。3人肝微粒体的制备采用差速离心法制各人肝微粒体，Bradford法测定肝微粒体蛋白含量。CYP2A6和CYP2C9的体外探针分别选择香豆素和甲苯磺丁脲，并以探针药物的生物转化程度(TR)作为反应速度。4探针药物及代谢物浓度的测定人肝微粒体孵育体系中加入探针药物、磷酸盐缓冲液等，预孵育后加入NADPH启动反应，孵育后加入高氯酸终止反应，涡旋、离心，取上清进行分析测定。并进行孵育条件的优化，选择最合适的孵育时间和微粒体蛋白浓度。实验所用探针药物及其孵育体系中

7、代谢物的浓度测定均选用HPLC法。结果表明，所建立的药物测定方法专属性高，精密度、回收率良好，RSD<15％，均符合生物样本的测定要求。5人肝酶动力学参数的测定CYP2A6底物香豆素的浓度范围为O．15625～20tiM，CYP2C9底物甲苯磺丁脲的浓度范围为31．25～2000／．tM。CYP2A6和CYP2C9孵育体系中蛋白浓度分别为0．3mg·mlJ和0．5mg·ml一，孵育时间分别为30min和60min，分别测定105例人肝CYP2A6和108例人肝CYP2C9的酶动力学参数Kl。、V。。。和CLi。t。6统计方法采用GraphP

8、adPrism5．0软件计算酶动力学参数，SPSSl7．0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。酶动力学参数进行正态性检验，对于非正态分布的，采取非参数检验进行相关分析。检验水准