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时间:2019-02-25
《内体酸化成熟障碍对lps活化巨噬细胞的调控作用及机制研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、第三军医大学硕士学位论文内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制研究姓名:杨洋申请学位级别:硕士专业:临床检验诊断学指导教师:郑江201205第三军医大学硕士学位论文内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制研究摘要脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS),是严重烧伤、创伤的常见并发症,进一步发展可导致多器官功能障碍综合症(multipleorgandysfuctionsyndrome,MODS
2、)和脓毒性休克(septicshock),严重威胁患者生命。革兰阴性菌外膜中的主要成分内毒素(Lipop01ysaccharide,LPS)是脓毒症的主要病原体相关分子模式(pathogen—associatedmolecularpatterns,PAMPs)。LPS与其模式识别受体TLR4(Tolllikereceptor4)结合后可启动MyD88依赖和TRIF/TRAM依赖的两条信号转导通路,活化单核/巨噬细胞,激活炎症因子的转录与释放,导致炎症反应,过度的炎症反应可诱导脓毒症的发生。内化(internalizat
3、ion)是指细胞通过胞吞作用将胞外物质转运入胞内的过程。LPS—TLR4复合物内化入胞进入早期内体,然后通过晚期内体运送至溶酶体降解代谢,这一过程伴随着内体的酸化成熟。近期研究表明,LPS的内化与其对细胞的活化密切相关,本课题组前期研究结果也显示,内化抑制后,LPS刺激巨噬细胞活化的程度明显降低;内体酸化成熟障碍可抑制巨噬细胞的活化,对炎症反应具有抑制作用,但机制尚不明确。同时还观察到CQ预处理抑制内体酸化成熟后内化的LPS—TLR4共定位消失,这与以往的认知相悖,而这一现象与LPS内化和活化细胞的关系及机制不明确。因
4、此,本研究旨在探讨内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制,为进一步深入研究LPS内化与细胞活化的关系及病理生理机制奠定基础。目的应用内体酸化成熟抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟,研究内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制。方法1.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的研究(1)CQ(20I,tg/m1)预处理RAW264.7细胞lh,LPS(100ng/m1)束lJ激24h后收集细胞培养上清液,ELISA法检测TNF.a和I
5、L一6在蛋白水平的表达情况。(2)采用siRNA技术抑制RAW264.7细胞MyD88、TRAM的表达,LPS(100ng/m1)第三军医大学硕士学位论文刺激24h后收集细胞培养上清液,ELISA法检测TNF一0【和IL一6蛋白水平的表达情况。(3)小鼠炎症细胞因子抗体芯片技术检测CQ预处理及siRNA干扰MyD88、TRAM后细胞上清中炎症介质总体的分泌情况,并进行对比分析。2.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的机制研究(1)CQ预处理后LPS—TLR4复合物共定位消失现象的研究①利用CQ(
6、20I.tg/m1)及另一内体酸化成熟抑制剂一氯化铵(5001xg/m1)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟,FITC—LPS(200ng/m1)束lJ激lh,激光共聚焦显微镜观察FITC—LPS与Cy3一TLR4在胞内的共定位情况。②cQ(20pg/IIll)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟后,6FAM—CpGDNA(100ng/m1)刺激30min,激光共聚焦显微镜观察6FAM.CpGDNA与Cy5.TLR9在胞内的共定位情况。③动态观察内体酸化成熟障碍后LPS与TLR4在胞内的共定位情况TLR4::YFP标
7、记质粒转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜观察。CQ预处理后于不同时相点观察LPS—TLR4的胞内分布情况。④内体酸化成熟障碍对内体循环相关调控分子表达的影响LPS(100ng/m1)束lJ激CQ(20/.tg/m1)预处理1h后的RAW264.7细胞,4h后,提取细胞总RNA,RealtimePCR法检测内体循环关键分子Rab7b、Rabl0、Rablla在核酸水平的表达情况。(2)内体酸化成熟障碍对炎症负调控分子表达的影响LVS(100ng/m1)*U激CQ预处理1h后的RAW264.7细胞,4h后,提取细胞总R
8、NA,RealtimePCR法检测负调控分子A20、Tollip及MyD88s在核酸水平的表达情况。结果1.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的研究(1)CQ预处理lh,LPS刺激后TNF—a和IL一6蛋白水平的表达被显著抑制。(2)siRNA技术抑制RAW264.7细胞MyD88、TRAM的表达后,TNF
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