mtor在tgf-β2诱导的人晶状体上皮细胞间叶样转化过程中的作用

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文mTOR在TGF．p2诱导的入晶状体上皮细胞间叶样转化过程中的作用mTORinTGF—D2inducedEMTinHLECs课题来源：自选课题专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员眼科学肖俐佳郭海科教授余敏斌教授陈伟蓉教授沙翔垠教授陆晓和教授张良教授论文评阅人郑丹莹教授曾锦教授2012年05月18日广州硕士学位论文mTOR在TGF．D2诱导的人晶状体上皮细胞间叶样转化过程中的作用摘要晶状体上皮细胞(Lensepithelialcells，LECs)对晶状体的生长发育、维持晶状体的正常生理功能至关重要。LECs生长、增殖、移行、分化和分泌细胞

2、外基质的等方面的异常是多种晶状体疾病特别是后囊膜混浊(postedorcapsularopacification，PCO)的基础【11。转化生长因子(transforminggrowthfactorp，TGF-p)是上皮细胞向间叶样细胞转化(epithelialtomesenchymaltransition，EMT)的关键因子【2】，现有研究表明，在TGF．p的几种亚型中，TGF．f12在房水中含量最高，且能有效诱导人晶状体上皮细胞(HumanlensepithelialcellsHLECs)发生EMT[31，目前已成为研究PCO时细胞模型的常用建造工具【4】。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ma

3、mmaliantargetofrapamycin，mTOR)是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期进程和细胞生长增殖过程中发挥中心枢纽的作用围。此外，mTOR能够促进细胞的黏附与移行，参与调节上皮细胞向间叶样细胞转化【6】，但是，mTOR是否在LECs中存在表达，以及mTOR在HLECs向间叶样转分化过程中的活化水平及其是否参与调节HLECs间叶样转化至今尚未见报道。目的明确mTOR在TGF．D2诱导的HLECs向间叶样细胞转化过程中的活化情况(磷酸化水平$2448．P，$2481．P)及作用。方法l建3ZTGF．B2诱导HLECs的EMT体外培养体系培养的HLECs．B3细

4、胞换用无血清DMEM培养基后，加入TGF．p2，使其终浓中文摘要度为10ng／ml，分别培养0h、lh、6h、12h、24h、48h，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化，westernblot法检测HLECs上皮细胞标志物缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)、上皮性钙黏附蛋白(E．cadherin，E—cad)和间叶样细胞标志物纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、n．平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscleaetin，Q．SMA)的表达水平。2weStemblot法检测mTOR及其磷酸化水平($2448一P，$2481．P)在TGF．f12诱导的HLECs的EM

5、T过程中的动态表达变化。3观察mTOR在TGF．f12诱导HLECs的EMT过程中的活化水平及其作用3．1确定mTOR抑制剂雷帕霉素和KU．0063794的最佳作用浓度。将浓度梯度为0riM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制剂雷帕霉素和KU．0063794分别加入HLECs．B3细胞，培养24h后，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化，westernblot法检测mTOR及其磷酸化水平($2448．P，$2481．P)。根据二者对mTOR磷酸化水平的抑制情况以及细胞的生长状态，选择下一步实验中雷帕霉素和KU．0063794的作用浓度。3．2观察mTOR在

6、TGF．艮诱导HLECs的EMT过程中的活化水平以及mTOR抑制剂对TGF．P12诱导HLECs向间叶样细胞转化的影响。3．2．1将实验分为以下组：对照组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培养基后继续培养24h。TGF．f12组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培养基后，终浓度为10ng／mlTGF-D2处理24h。雷帕霉素组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的雷帕霉素(最佳浓度由上述实验3得到)处理24h。KU．0063794组：常规培养的HLECs．B3

7、细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的KU．0063794(最佳浓度由上述实验3得到)处理24h。雷帕霉素+TGF．f12组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的雷帕霉素预处理lh后，lOng／mJTGF-艮处理Ⅱ硕士学位论文24h。KU．0063794+TGF．D2组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基