tgf-β2通过pi3kakt信号通路诱导人晶状体上皮细胞上皮—间质转化

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1、南方医科大学2010级博士学位论文TGF．132通过P13K／Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞上皮．间质转化TGF—P2inducesEMTofhumanlensepithelialcellsthroughtheactivationofP131GAktsignalingpathway课题来源：广东省自然科学基金项目学位申请人郭瑞导师姓名郭海科专业名称眼科学培养类型委托培养培养层次博士研究生所在学院研究生学院2013年3月8日广州博士学位论文TGF．132通过P13K／Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转

2、化I掣M24IlloLIIM65IIIl3UII攀博士研究生：郭瑞指导教师：郭海科摘要后发性白内障是白内障术后最常见的并发症，尽管手术技术的进步和人工晶状体材料及其设计的发展已经降低了后发性白内障的发生率，它仍是白内障术后视力下降的主要原因。目前认为后发性白内障的发病机制是手术残留的晶体上皮细胞异常的增殖、纤维化、移行并伴随细胞外基质的分泌。上皮细胞上皮．间质转化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)是指上皮细胞获得间质细胞的特征，是后发性白内障发生的细胞学基础，通过该转化，晶

3、状体上皮细胞间连接消失，细胞迁移能力增强。转化生长因子-9(transforminggrowthfactor-p，TGF-p)是一种多功能蛋白质，属于转化生长因子．D超家族蛋白的成员，具有调节多种细胞的生长，分化、凋亡和免疫等多项功能。转化生长因子．p是晶状体在各种生理和病理状态下重要的调节因子，能够干扰正常的晶状体结构，并能够诱导晶状体上皮细胞发生异常的增殖、分化和凋亡，与囊膜下型白内障以及后发性白内障的形成有着密切的关系【l‘3J。转化生长因子．D包括三种TGF．p同源异构体，转化生长因子．pl，转化生长因子

4、．p2和转化生长因子．p3，其中转化生长因子．p2在眼内房水及玻璃体内的含量及活性最高，是参与调节晶状体上皮细胞最强的细胞因子之一。TGF．p2可以诱导晶状体上皮细胞发生上皮．问质转化，使晶状体上皮细胞丧失上皮细胞的极性，获得较强的迁移、侵袭和抗凋亡的能力等间质特性，从而具有类肌纤维母细胞样的特征。目前TGF．p2诱导晶状体上皮细胞上皮．间质转化摘要细胞模型已成为白内障(包括前囊膜下和后囊膜混浊)形成的细胞模型而被广泛研究。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶

5、相关蛋白激酶家族，广泛的存在于哺乳动物的细胞浆中。mTOR信号通路与多种细胞的生长、增殖、分化、迁移、自我更新和细胞周期等密切相关，被认为是一个调节细胞周期进程和细胞生长增殖的信号汇聚点。mTOR可接受生长因子、营养(氨基酸)和能量等多种信号，通过包括P13K／Akt信号通路在内的多条信号通路来发挥作用。目的研究P13K／Akt信号通路在TGF．p2诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化过程中的作用及其机制，以期为后发性白内障的发病机制提供确切的理论依据，为后发性白内障及此类疾病的药物干预提供新的靶点和新的思路及方法

6、。方法1建立TGF—D2诱导HLECs(humanlensepithelialcells)间叶样转化的体外培养体系常规培养HLECs．B3细胞系，待其长至80％融合时，去除培养液，PBS冲洗3次，加入不含FBS的DMEM培养基。加入TGF．p2，使其终浓度为10ng／ml，置于细胞培养箱中培养24小时。共聚焦细胞免疫荧光和westernblotting法检测HLECs．B3细胞的上皮细胞标志蛋白——缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)和间质细胞标志蛋白——纤维连接蛋白(fibronectin，FN)

7、的表达变化。2检测P13列Akt信号通路主要信号分子在TGF．p2诱导HLECs发生EMT过程中的表达变化westemblotting法检测P13眦信号通路主要信号分子，P13K、Akt和mTOR的表达情况及其磷酸化水平变化。共聚焦细胞免疫荧光法检测各组细胞P．Akt在细胞内的定位。3CCK．8实验检测P13K抑制剂LY294002对HLECs细胞增殖的影响博士学位论文在96孔板中培养HLEC．B3细胞，向培养板加入LY294002，使其终浓度分别为O／tM、10“M、20pM、30pM、40肛M、50／aM、6

8、0肛M、70pM和80pM，培养箱内培养24d,时，向每-TLDI：I入10llLCCK．8溶液继续培养，分别于1h、2h、3h上酶标仪检测各孔吸光度(A)值，计算增殖抑制率。4观察P13K抑制剂LY294002对TGF．p2诱导HLECs细胞上皮间质样转化的影响。4．1将细胞进行以下分组：对照组：常规培养的HLECs．B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培