lps诱导胆管上皮细胞toll样受体4及上皮间叶样表型转化相关标志物表达变化的实验研究

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1、遵义医学院硕士学位论文LPS诱导胆管上皮细胞Toll样受体4及上皮一间叶样表型转化相关标志物表达变化的实验研究(Toll．1ikereceptors，TLR)是单个的跨膜非催化性蛋白质，当微生物突破机体皮肤、粘膜时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。TLR存在于多种细胞中，如骨髓细胞(巨噬细胞、T细胞、B细胞)，非骨髓细胞(上皮细胞及纤维细胞)。Toll样受体4(Toll．1ikereceptors4，TLR4)是最早发现的Toll样受体亚型之一，是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TL

2、R4作为Toll样家族中的一员，广泛分布于单核细胞、血管内皮细胞、小肠上皮细胞、呼吸上皮细胞、单核细胞、大鼠脾和心肌细胞等【6】，主要表达于细胞质或细胞膜。目前研究表明，TLR4在组织炎性化和纤维化中的表达有所增高，提示其可能在组织发生炎性反应及其之后的纤维化过程中发挥着重要作用。LPS作为TLR4的配体，TLR4可特异性的识别LPS，表明TLR4与LPS信号传递中关系密切，TLR4可能是LPS信号转导的主要受体。随着TLR4机制应用越来越广泛，TLR4在胆管纤维化和胆管狭窄中的作用研究也越来越重要，明确TLR4在此过程中的关键作用是临床上治

3、疗肝胆管结石及防治肝胆管纤维化的又一切入点。综合国内外文献报道及本课题组前期试验研究结果，TLR4在LPS诱导的胆管上皮细胞EMT过程中可能发挥了重要作用，从而参与了胆管纤维化及肝胆管结石的发展。为了验证此推测，我们采用PCR来检测EMT相关指标在胆管上皮细胞经LPS处理后的表达情况，进行初步探讨Toll样受体4在胆管上皮细胞EMT转化中的作用。遵义医学院硕士学位论文LPS诱导胆管上皮细胞Toll样受体4及上皮一间叶样表型转化相关标志物表达变化的实验研究材料与方法1实验材料1．1细胞来源购买人肝内胆管上皮细胞株HIBEC，1．2主要试剂F12

4、培养基新生胎牛血清LPSPBS粉剂RNAisoPlus(TotalRNA提取试剂)反转录反应试剂盒SYBRPremixEXTaqIIPCRForward／ReversePrimer0．229m除菌滤器1．3主要仪器超净工作台：月坛牌1300A型5％C02培养箱6、24孔平底培养板．80℃低温冰箱．20℃低温冰箱倒置显微镜数码相机RNA逆转录仪荧光定量PCR仪器BS210S电子天平台式冷冻高速离心机5804R型DU．800紫外分光光度计ELx800酶标仪购自美国ScienCell，编号：5200。美国ScienCell杭州四季青生物公司宝生物工

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6、书，将粉末溶于2LddH20中，调至PH=7．2即可。1．4．2血清的处理分装将新生牛血清200ml解冻后放入56℃灭活处理30分钟，将血清分装为20ml／瓶，放入一20℃冰箱保存备用。1．4．3双抗的配制取80万单位青霉素、100万单位链霉素，将双抗分别溶于10ml生理盐水中，取青霉素溶液10ml，链霉素溶液8ml，一起溶于62ml生理盐水，配成1万单位／ml的双抗溶液，分装成2-5ml／瓶，放入。20℃冰箱保存备用。1．4．4培养液配制在79mlF12培养基中加入20ml新生胎牛血清及lml双抗配成100ml培养液，将配制好的培养液放入4

7、。C冰箱保存备用。1．4．51‰焦炭酸二乙脂水(DEPC)配制1009lDEPC原液溶于100ml蒸馏水中(比例为1：1000)，磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌，自然冷却后备用。2实验方法2．1细胞培养及传代胆管上皮细胞株复苏后培养至细胞生长达80％以上传代。弃去培养瓶中的培养基，用预热至37℃的PBS轻轻清洗细胞单层2次，加入预热的0．25％的胰蛋白酶lml，倒置显微镜下观察细胞体积变小，细胞皱缩，细胞间隙增大时，加入培养基终止消化。无菌吸管反复吹打后制成细胞悬液。将悬液收集入15ml无菌离心管中，1000r／min，离心5min，弃去上清液

8、，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，按照1：2或者1：3的比例传代继续培养。2．2标本采集将细胞分为对照组及实验组(LPS诱导组)，实验组按LPS2p,g／ml浓度分别诱导