smad4基因沉默对大肠癌细胞侵袭能力影响

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1、lIIIIIIJlIIIIIII《IIIIII{Y2297477中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：；垦堡出日期：Ⅻf；．彳·g中国医科大学研究生学位论文版权使

2、用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：盘量些指导教师签名日期目录一、摘要中文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·l英文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··6三、论文前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23四、附录综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

4、．39个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．40·中文论著摘要·Smad4基因沉默对大肠癌细胞侵袭能力的影响●_■一’。‘一刖吾大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，给社会造成了沉重的负担。恶性肿瘤细胞粘附作用的减弱和缺失是导致肿瘤侵袭转移的重要原因。转化生长因子lB／Smad(Transforminggrowthfactor-p，TGF．13)信号转导通路在大肠癌的发展，演变及侵袭转移中起到重要的作用。Smad4作为一个肿瘤抑制基因是该信号通路的中心分子。本研究通过RNA干扰技术特定抑制Smad4蛋白在

5、大肠癌细胞中的表达，并观察其对粘附作用的影响，来探讨大肠癌细胞的侵袭转移机制，为临床治疗提供理论依据。实验方法l、Smad4．shRNA表达质粒的构建：参考相关文献，使用Ambion公司的在线设计软件，合成了能够编码Smad4基因的小发夹RNA(Smad4．shRNA)的DNA模板，并将其插入到pSliencerTM4．1．CMVneo表达质粒中，得至lJpSliencerTM4．1．CMV-Smad4．shRNA重组质粒；然后将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆并进行扩增：通过

6、PCR及基因测序筛选出正确插入的Smad4一shRNA表达质粒；2、HCT-116一Smad4一RNAi细胞模型的建立：应用碱裂解法提取质粒，脂质体转染法转染人大肠癌HCTll6细胞，westernblot法检{贝!lSmad4基因的沉默效果；3、相关指标检测：采用westernblot法检测Smad4基因沉默前后MMP2，MMP9表达的变化；流式细胞仪检测细胞周期、凋亡的变化；细胞计数法检测细胞的增殖力，Transwell法检i贝tJSmad4基因沉默前后细胞侵袭能力的变化。实验结果1、Smad4．shRNA表达质粒的成功构建

7、：含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为250bp，并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确，说明Smad4一shRNA表达质粒构建成功；EGFP证明转染效率约为70～80％。2、成功建立HCT-116．Smad4．RNAi细胞模型：与对照组相比，转染Smad4．shRNA质粒24、48和72小时后，Smad4基因的蛋白表达水平均明显降低(尸

8、：与对照组相比，Smad4基因沉默后细胞的增殖力明显增强，且S期细胞增多，早期凋亡的比例明显降低。同时Transwell可见HCT-116细胞的侵袭作用较对照组明显增强(P