大鼠fasl基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验的研究

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1、徐州医学院硕士学位论文LVFCMFasLRPMPBSOD1HCEUSARrr-PCRDMEMESRDMHCMMPFADDDCDABVSV二GFBSCMV缩略词表lentiviralvector慢病毒载体FlowCytometry流式细胞仪FasLigandFas配体roundperminute每分钟转数phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液opticaldensity光密度immunohistochemistrv免疫组化enzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验Rervesetranscriptionpolymerasechainrea

2、ction逆转录聚合酶链反应Dulbecco’smodifiedEaglemediaDulbecco改良培养基endstagerenaldysfunction终末期’肾功能不全majorhistocompatibilitycomplex主要组织相容复合体matrixmetallo口roteins金属基质蛋白Fas．associateddeathdomainFas相关死亡结构域dendriticcell树突状细胞3，3’-diaminobenzidine3,3’一二氨基联苯胺Vesicularstomatitisglycoprotein水泡性口炎病毒G糖蛋白Fetalbovineserum胎

3、牛血清Cytomegalovirus巨细胞病毒徐州医学院硕士学位论文大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验研究中文摘要目的：三质粒系统包装合成大鼠FasL基因重组慢病毒载体并用慢病毒载体体内、外转染大鼠肾细胞，研究转染后FasL的表达。为进一步进行同种异体肾移植动物实验、研究FasL基因转染在同种异体移植中诱导免疫耐受的作用奠定基础。方法：1．三质粒系统共转染293--T包装细胞，收集上清并用P249agELISA试剂盒对其定量。2原代培养大鼠肾细胞，FCM测定其Fas、FasL的表达。3．分别用空白慢病毒载体及FasL慢病毒载体体外转染原代培养大鼠肾细胞，RT—PCR、We

4、stern．blot鉴定转染结果。4．分别用空白慢病毒载体及FasL慢病毒载体经肾动脉体内转染，于3天、7天、15天、25天、40天取肾标本，切片后分别用HE、IHC染色，观察有无肾细胞形态改变、炎细胞浸润、转染后目的基因表达结果。结果：1．三质粒系统共转染293一T包装细胞合成慢病毒载体，P249agELISA法对其定量，空白慢病毒载体及FasL慢病毒载体体浓度分别为13．8ng／ml、11．6ng／ml。2．FCM测定大鼠原代培养肾细胞Fas、FasL的表达分别为3．36％、2．47％。3．慢病毒载体体外转染大鼠肾细胞，RT-PCR结果显示目的基因载体在870bp有明显条带，而空白慢病

5、毒载体未见明确条带，Western—blot鉴定目的基因载体有明显显色条带，而空白慢病毒载体未见显色。4．慢病毒载体体内转染l肾脏，目的基因载体各时段样本HE染色未见肾细徐州医学院硕士学住论支胞形态改变及炎细胞浸润，与空白组比较无明显差异。IHC染色目的基因载体转染后15天出现表达高峰，经统计学处理15天、25天组与空白组比较有统计学意义(P0．05)。结论：1．成功合成FasL慢病毒载体并用P249agELISA对其定量。2．大鼠肾细胞低表达Fas、FasL，适用于转FasL研究。3．体外成功转染大鼠肾细胞

6、并转录、表达目的基因。4．体内转染后慢病毒载体及FasL的表达不会引起细胞形态改变及炎细胞浸润，说明慢病毒体内转染是安全的。IHC转染后15天出现表达高峰，15天、25天组与对照组比较有统计学意义，而其它时段与对照组比较无统计学意义，表明慢病毒载体体内转染效率有待提高。关键词：FasL慢病毒载体转染徐州医学院硕士学位论文TheexperimentalstudyofthetransfectionofratrenalcellsinvivoandvitrobytheratFasL-cDNArecombinantlentiviralvectorABSTRA(玎Postgraduate：LvQing

7、dongDirector：ProLSunXiaoqingobjective：TopakageratFasL-cDNArecombinantlentiviralvectorbythethree—plasmidsystemandquantifyitwithP249agELISA．Testitstransfectingabilityofratrenalcellsinvivoandinvitroandstudytheexpres