人ercc1基因启动子荧光素酶报告基因质粒构建

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1、AERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒构建【摘要】目的：构建人切除修复交叉互补基因1(excisionrepaircrosscomplementation1,ERCC1)启动子荧光素酶报告基因质粒。方法：以人基因组DNA为模板,扩增ERCC1启动子，将其重组到荧光素酶报告基因载体pGL4Basic中，测序验证构建的质粒中包含ERCC1启动子序列。结果：测序结果正确，质粒pGL4-ERCCl-Pl构建成功。结论:人ERCC1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功，可以用于后续基因表达调控的研究。【关键词】报告基因；ERCC1；启动

2、子中图分类号R文献标识码B文章编号1674-6805(2014)14-0144-02ConstruetionoftheHumanERCC1LuciferaseReporterPlasmidPromoter/SONGYing,GUYi-xue,QIUQin-wei,etal.//ChineseandForeignMedicalResearch,2014,12(14)：144-145[Abstract】Objective：Toconstructahumanexcisionrepaircrosscomplementation1(ERC

3、C1)promoterluciferasereporterplasmid.Method：TheERCC1promoterfromhumangenomicDNAwasamplifiedbyPCR,andwasinsertedintothepGL4Basicvector.TheamplifiedDNAsequencewasconfirmedbysequencing.Result:DNAsequencingverifiedthesuccessfulconstructionoftheplasmidpGL4-ERCCl~P1.Conclu

4、sion:ThehumanERCC1promoterluciferasereportergenevectorissuccessfullyconstrueted，whichcanbeuseforfurtherstudyongeneexpressionregulation.［Keywords】ERCC1；Luciferasereportergene；PromoterFirst-author^saddress：AffiliatedCancerHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou5

5、10095,China切除修复交叉互补基因1(excisionrepaircrosscomplementation1,ERCC1)是核昔酸外切修复酶家族重要成员之一，同时也是核昔酸酶切修复系统和链内交联修复DNA途径中的关键基因［1］。有研究表明，该基因与肺癌的钳类化疗耐受相关，但是目前尚未有人报道ERCC1的转录调控机制［2］。本文拟构建人ERCC1启动子荧光素酶报告基因，对进一步研究ERCC1基因的表达调控和揭示肺癌的钳类耐药机制提供有力的工具和手段。1材料与方法1.1实验材料质粒小提试剂盒(Plasmidminikit)和

6、琼脂糖凝胶回收试剂盒(GelExtractionkit)购自OMEGA；限制性核酸内切酶BglII.KpnI.T4DNA连接酶均购自Fementas；1KbDNAmaker和PremixTaqTM(LATaqTMVersion2.0)均购自TAKARA；DNA提取试剂盒(TIANmnpGenomicDNAkit)购自TIANGEN；大肠杆菌感受态Top10和质粒pGL4Basic为本室保存。1.2引物的合成与基因扩增根据GenBank上人ERCC1基因第一个外显子第一个碱基为+1,选取上游-3000bp序列，作为ERCC1的启动

7、子序列，用引物设计软件Primer5.0设计引物。为了便于回收扩增片段，在基因序列5'端分别加上BglII和Kpn1酶切位点(下划线处)。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。ForwardPrimer:5，-CCGggtaccGGGTCTGATTGAGATTTTGGGTC-3,ReversePrimer：5，-CCGagatctCCTTGTAAAACGTTGCCTTCACT-3^o提取人肺癌细胞A549细胞的基因组DNA,并以此为模板，用LATaq进行PCR反应，扩增人的ERCC1启动子(ERCC1-P1)序列。PCR反应条

8、件：预变性95°C5min,变性95°C30s,退火58°C30s,延伸72°C3min,共循环32次，最后72°C延伸10min。1.3人ERCC1报告基因的构建PCR产物经过1%琼脂糖分离，切胶后使用胶回收试剂盒回收，然后用限制性内切酶Bglll和Kpnl进