海肾荧光素酶报告基因

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划海肾荧光素酶报告基因　　双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项　　转载请注明来自丁香园发布日期：XX-03-2613:43文章　　分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网　　关键词：双荧光素酶报告基因载体点击次数：24521．报告基因检测受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。　　2．细胞培养时

2、间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。　　3．双荧光素酶报告基因的载体选择：　　a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；　　b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子，而选用中等强度的启动子。　　4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。　　5．最适反应温度：室温。各个组分都需要调整到室温。目

3、的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　6．双荧光素酶反应体积：20ul-100ul-100ul，底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差　　7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年　　8．裂解产物与底物混合：要求混合快速、混合时间一致，避免

4、荧光素酶衰变的影响。　　9．发光半衰期：　　a)单荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min　　b)双荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min　　10．检测结果　　检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；　　样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。　　荧光素酶报告

5、基因检测　　?原则目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下：　　1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。　　2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中。　　3)加入含有所有酶反应成分，使化学发光反应开始。　　4

6、)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。　　?特点　　?敏感度和检测范围：5fg荧光素酶　　?发射光的线性范围：10fg—10ng　　?确切的检测限依检测仪器而定。　　?特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶　　基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。　　?器材和试剂　　?器材　　在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。　　?试剂　　1

7、)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些　　试剂可以启动酶反应。这种目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~-25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在光照下会发生

8、氧化。　　2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。　　?基本操作步骤　　下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。　　1)将荧光素酶报告基因与?-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。　　2)彻底吸去培养皿中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液　　小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl100g，KCl，Na2HPO4，KH2P